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2005年11月17日 基因给药 药学院药剂教研室 蒋晨 背景知识 基因治疗 基因治疗的利与弊 基因治疗的途径 基因治疗方式 ①基因补偿：把有正常功能基因转入靶细胞以补偿缺失或失活。 ②基因纠正：消除原药异常基因，以外源基因取代之。 ③基因代偿：外源正常基因表达水平超过原药的异常基因表达水平。 ④反义技术：用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段或其化学修饰产物抑制或封闭异常或缺失的基因表达。 必然 适用 准必然 适用 相对 适用 相对 不适用 不适用 基因治疗的利与弊 DNA Viral vector Nake DNA plasmid RNA Anti-sense ribozyme RNAi plasmid 制备siRNA5种不同方法的比较 制备siRNA5种不同方法的比较（续） 基因治疗的途径 外来基因进入细胞 外来基因表达的障碍 靶细胞 靶器官的特异性识别 避免非特异性摄取（RES的非特异性摄取） 避免系统循环中的降解（PEG的作用，降低免疫源性） 跨越细胞膜 核转运 基因表达调节 长期表达 DNA细胞转运 DNA细胞外的稳定性（核酸酶） 细胞膜的相互作用（递释系统的特性） DAN细胞内摄取（内吞、融合） 质子海绵 pH敏感 融合 DNA细胞质转运（降解） 核转运 基因载体 病毒载体 非病毒载体 病毒载体 病毒感染细胞 病毒载体的问题（逆转录病毒） 治疗基因插入逆转录酶病毒载体，再进入患者细胞中与DNA结合。病毒载体虽经过处理可防止感染，但无法控制病毒载体在DNA上的插入位置。 担心病毒载体会破坏重要基因，导致“插入型突变”。如果破坏的是负责调控细胞生长和分裂的基因，就会产生癌症。 可通过改造逆转录酶病毒减少插入变异的风险。 可行的办法是给载体安上“自杀”基因。用特定抗病毒药物让病毒“自杀”，将癌症消灭在萌芽阶段。 病毒载体的问题（腺病毒） 免疫反应 广泛感染 不插入宿主的染色体 病毒改造例－1 病毒改造例－2SeV 小结 非病毒载体 优点 低毒，低免疫原性 外源基因整合几率低 无基因插入片断大小限制 使用简单、制备方便 易于生产、便于保存和检验 缺点 携带基因表达时间短 细胞转染效率低下 非病毒载体分类 裸DNA 脂质体载体阳离子多聚物 多聚左旋赖氨酸、聚乙烯亚胺(PEI) 、壳聚糖及其衍生物、树状高分子载体 多肽导向载体系统 多肽载体的DNA结合部分多是碱性氨基酸,如精氨酸.赖氨酸.组氨酸 SiO2纳米载体 以无机二氧化硅为外壳制备的纳米颗粒具有良好的生物相容性,对细胞的生长和代谢没有明显的影响 嵌合载体 非病毒载体与病毒载体的联合应用,非病毒载体之间的联合应用(主要是脂质体与阳离子多聚物的联合应用) 裸DNA 特点： 将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其它物质的介导,是最简单的非病毒载体系统。 研究概况： 1990 年,Wolff首次报道了直接注射裸DNA到骨骼肌肉中,可检测到基因产物的明显表达。 另有研究发现，血管内注射裸DNA，外源基因在所有组织中均有表达，在肝脏组织中的表达高于或近似于腺病毒载体介导的基因转移(Budker et al., 1998)。 应用： 目前裸DNA技术不但用于DNA疫苗的制备,而且还可用于一些药物蛋白的表达,如红细胞生成素( EPO) 、瘦素(leptin)等。 脂质体或脂质复合物 特点： （1）阳离子脂质的一端拥有1～2 条由12～18 个碳原子组成的疏水链,使其在水性介质中形成双层结构,并包裹DNA ;另一端为亲水性的N+ 头部,通过静电力与DNA 结合以形成脂质复合物。 （2）阳离子脂质体本身带有正电荷,可以与带有负电荷的质粒DNA 通过静电作用紧密结合,形成脂质体与DNA 的复合物,可保护DNA 不受DNA 酶降解。 研究概况： 1987 年, Felgner首次报道了利用脂质体可体外转染培养细胞。 利用脂质体转移复合物较易凝聚形成大颗粒的原理建立了一种肺内高转染效率的脂质体载体系统(Anwer et al., 2000)。 Liu等将脂质体与血管表皮生长因子（VEGF）复合，然后与编码16个氨基酸的cDNA结合形成复合物，大鼠生存率提高14％，未观察到任何不良反应(Liu et al., 2004)。 应用： 现已成为将外源基因导入真核细胞的常规载体，在临床许多方面得到应用，如用于治疗肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等。已经有商品化的产品,其中以Lipofection 公司的产品最为著名。 脂质体和阳离子脂质体 Lipofectamine 2000 Lipofectamine 2000转染效率 聚合物 聚L-赖氨酸（PLL） 特点：细胞摄取和基因转染在有或