Pi显微镜和SSIM-中国显微图像网.PDF

4Pi显微镜和SSIM 中国显微图像网 学习资料 背景  1、传统显微镜分辨率限制，XY侧向分辨率200nm， Z轴分辨率500nm  2、电子显微镜虽然能提供纳米级分辨率，但不能观 察活细胞。  3、对于生命科学中的各种应用，改进光学显微镜的 空间分辨率非常重要。过去二十年进行的改进极大地 促进了显微镜的分辨率。 提高分辨率的四类方法  普通和共聚焦显微镜  干涉方法（4Pi ）  非线性方法（SSIM ）  表面方法（TIRF ） PSF 4Pi显微镜  为什么需要4Pi  目前在生物医药领域的研究，越来越受到显微镜分辨率的限制。 科学家需要了解各种微小形态物质的3维结构，然而传统白光和 激光共聚焦显微镜的光斑尺寸无法达到这样的分辨率。电镜和原 子力显微镜虽然可以提供更高的分辨率，但是只能局限于提供表 面图像，对于活细胞分析无法提供帮助。  4Pi共聚焦系统的出现完美地解决了这个问题。 原理  4Pi是空间立体角的数值。  由瑞利数据可知，增加物镜的 接受角（等效增加物镜的NA）， 可以减小PSF的尺度从而提高 分辨率。4Pi工具扫描显微镜利 用这一概念，通过样品前后的 双物镜使总的接受角接近4Pi ， 进而提高NA值。 历史  1992年，hell制造出4Pi显微镜  1998年，将专利卖给Leica  Leica推出商用4Pi显微镜，并获得2005年德国 技术与创新奖 结构特点  4Pi基于宽场或共聚焦显微镜平台， 采用两个相对的相同物镜，将轴向分 辨率由500nm提高到110nm，为固定 样品或活细胞的亚细胞结构、细胞内 寄生虫和病毒等的观察提供无与伦比 的3D效果。  可采用63x水镜或油镜，或100x的油 镜或甘油镜；  100nm的Z轴分辨率。  （利用4Pi成像结果，3D重建的血红细胞模型） MMM-4Pi记录活酵母线粒体，用荧光标记，器官展示出单个个体的管形 结构，细胞膜在外部，被染成蓝色。每个箭头长度约1um。 分类  单光子4Pi共焦扫描显微镜  双光子4Pi共焦扫描显微镜（看得深）  多焦点多光子4Pi显微镜（MMM-4Pi ）（速度 快） MMM-4Pi  多焦点多光子MMM-4Pi显微镜采用 微透镜装置将一束激光分为若干束， 一次获得多点信息，扫描获得全场图 像，大大缩短了整幅图像获取的时间。 采用快速CCD，还可以进一步缩短图 像获取时间，提高成像速度。  要求：由于采用双光束干涉照明，波 前更容易受到折射率失配和折射率不 均匀分布的影响，因此这类显微镜要 求样品透明度要好，也限制了厚度， 在几微米至几十微米之间。  以上的光学草图揭示出MMM-4Pi显微镜包括两个部分：头部和轴向扫描部分。 MMM-4Pi显微镜的头部包括分光镜和物镜镜头。通过在光轴（Z轴）上移动样品 进行扫描，共聚焦也是如此。多焦点光束扫描部分在草图的下部分。  锁模式Ti ：Sapphire 激光的光束被焦面上一系列微透镜分开，产生一个n Xm的 光点微阵列，在通过一个二次分光镜后，聚焦在一列针孔上。这个针孔用于创造 4Pi照亮样品的点状光源。在通过针孔后，每个光点被一个消色差镜头校正，直 接打到一个快速倾斜的振镜上。以下的镜头确保振镜成像在物镜透镜的出瞳。快 速的倾斜镜头可以使4Pi照明在X方向进行侧向扫描。  一列微透镜把脉冲激光分成一列小光点，聚焦在针孔阵列上。针孔纯化以后，小 光点被扫描镜检测，直达4Pi头部，通过使用分光镜，在样品内部会产生一列反 向传输照明焦点。  通过移动样品完成轴向扫描，Y轴上的扫描通过转换相连的针孔和微透镜完成。 应用 •快速分辨活酵母体内线粒体结构的粘性，分辨率达到100nm •科学家利用多光子多焦点4Pi共聚焦显微镜第一次得到真核活细胞 100nm下的三维图像。这个图像