生化实验课件-动物肝脏中DNA的提取和测定.ppt

动物肝脏中DNA的提取和测定 实验1 动物肝脏中DNA的提取 一. 实验目的 掌握浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术 二. 实验器材 匀浆器 量筒 离心机 离心管 试管 吸管 恒温水浴锅 实验1 动物肝脏中DNA的提取 一. 实验耗材 1. 猪肝 2. 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠溶液（pH6.8） 3. 0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液 (NaCl 0.828g及柠檬酸三钠0.341g定容至1000ml） 4. 95%乙醇（A.R.） 5. NaCl固体（A.R.） 6. 5%SDS溶液（5g SDS 定容至100ml） 7. 氯仿（A.R.） 8. V(氯仿)：V（异戊醇）20：1的混合液 实验1 动物肝脏中DNA的提取 四. 实验操作 称猪肝4g，用匀浆器磨碎（冰浴），加入8ml 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研 磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min 下离心10min沉淀中再加入12.5ml缓冲液，于 4000r/min离心20min；弃上清，取沉淀。 实验1 动物肝脏中DNA的提取 2. 在沉淀中加入20ml柠檬酸钠缓冲液、10.5ml氯仿-异 戊醇混合液、2ml SDS使其最终浓度为0.41%，振荡 30min，然后缓慢加入固体NaCl（约1.8g），使其最 终浓度为1mol/L。将其在3500r/min离心20min，取 上清水相。 3. 在上述水相溶液中加入等体积冷乙醇，边加边用 玻棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶 状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA 粗品。用蒸馏水溶解并定容至25ml。 实验2 DNA的定量测定（二苯胺法） 一. 实验目的 掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法 二. 实验器材 坐标纸 试管 吸管 722型分光光度计 恒温水浴锅 实验2 DNA的定量测定（二苯胺法） 三.实验耗材 1. DNA标准溶液（取DNA钠盐用5mmol/L的NaOH 配成200ug/L的溶液） 2. 二苯胺溶剂（纯二苯胺1g溶于100ml冰醋酸 （A.R.）再加入10ml过氯酸（A.R.浓度60%） 混匀待用。临用前加入1ml 1.6%乙醇溶液） 3. DNA样液（将实验1提取的DNA粗品用蒸馏水 溶解，定容至25ml，控制其DNA含量在100ug/ml 左右） 实验2 DNA的定量测定（二苯胺法） 四. 实验操作 1.标准曲线的绘制 按表1加入各种试剂，混匀，于60°C恒温水浴45min，冷却后， 在595nm波长下于分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作 图，制作标准曲线。 2.样品的测定 取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0ml，混匀。然后准确加入二苯 胺试剂4.0ml，混匀，于60°C恒温水浴45min，冷却后，595nm 波长下于分光光度计比色测定，根据所测的吸光度对照标准曲线 求得DNA的质量（ug）。 实验2 DNA的定量测定（二苯胺法） 四. 实验操作 3.计算100g猪肝中DNA含量 w=m1/m2×100% w : DNA的质量分数（%） m1：样液中测得的DNA的质量（ug） m2：样液中所含样品的质量（ug） * * A595nm 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 二苯胺试剂/ml 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水/ml 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 标准DNA溶液/ml 5 4 3 2 1 0 *