生化设计性实验 枸杞果实RNA的分离和鉴定.doc

真核细胞RNA的分离目前大致有6种方法：热硼酸法、CTAB法、Trizol法、SDS法、皂土法、异硫氰酸胍法。另外CTAB法与SDS法均有其不同的改良法。由于植物组织中的多酚、多糖、蛋白质以及其他次生代谢物质的存在严重影响了RNA的提取，因此我们所查文献中关于植物RNA分离的较多。由于不同植物的不同部位生长情况不同，因此分离RNA的方法也各有优劣。下面一一介绍这6种方法。 1.CTAB法 1.1适用范围 CTAB法主要适用于木本植物RNA的提取.用CTAB法或经过改良的CTAB法可以从内含物丰富的植物材料,如苹果属植物、银杏、草坪草、细毛樟、月季花瓣、茄属植物、烟草、毛茛花、荔枝树皮当中提取到较高质量的RNA。 1.2优缺点 CTAB法及其改良法步骤比较简单,耗时相对较短,成本也相对较低,对于内含物较丰富的植物的提取效果也很好.提取步骤的简化可以减少Rnase污染的机会,减少RNA的降解.并且在提取RNA的同时可以得到较好质量的DNA,提高了效率. CTAB法及其改良法抽提缓冲液都包括CTAB、Tris-HCl(pH 8.0)、NaC1、EDTA (pH 8.0)。其中，CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使RNA得以游离出来；EDTA以螯合二价金属离子抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；NaC1溶液提供缓冲反应环境。另外在缓冲液中添加苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性并使抽提液分相，由于RNA溶于水相，因此经离心后即可从抽提液中去除细胞碎片和大部分蛋白质；上清液中加入的无水乙醇可使 RNA沉淀，将沉淀出的RNA溶于TE溶液中即得RNA溶液；添加的还原剂(如β-巯基乙醇)和鳌合剂(如PVP) 可防止多酚氧化；低浓度乙醇或醋酸钾可去除多糖，从而高度纯化RNA。 2. Trizol法 2.1 适用范围 Trizol法多用于动物组织细胞以及微生物的RNA提取,对于植物材料,一些内含物质较少的草本植物,比如草坪草、小麦、豌豆、水稻、以及一些茄属植物的叶片,用Trizol法可以得到较高质量的RNA,对于少数木本植物如构树也可以用Trizol法得到较好质量的RNA. 2.2 优缺点 Trizol法即异硫氰酸胍—苯酚法比较简单方便,耗时也比较短, 该法中使用异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸并可以抑制RNA酶、防止RNA的降解；使用酚使蛋白变性；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。 但是可能由于步骤比较简单,对杂质的去除不够彻底对细胞壁较厚的组织裂解可能不够完全,所以胞壁较厚、内含物较多的材料用Trizol法提取的效果不好.另外Trizol试剂价格昂贵、成本较高,所以不适用于总RNA的大量提取. 3．SDS-LiCl法 3.1 适用范围 SDS-LiCl法能从内含物比较少的材料中获得质量较好的RNA,比如拟南芥。虽然SDS-LiCl法也能分离内含物较丰富的植物如苹果榕、半夏叶片的RNA，但总体效果不好。 3.2 优缺点 SDS-LiCl法提取液有Tris-HCl (pH8.0)、mol/L EDTA (pH8.0)、mol/L NaC1、SDS、β-巯基乙醇。SDS是一种离子去污剂，能从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖；EDTA以螯合二价金属离子，抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；NaC1溶液可提供缓冲反应环境。在缓冲液中加入抗氧化剂或强还原剂(如β-巯基乙醇)，可以降低酶类(尤其是氧化酶类)的活性。通过苯酚和氯仿等有机溶剂的抽提去除蛋白质、多糖和酚类等杂质后，加入无水乙醇进行沉淀，即可使RNA分离出来。 但对内含物质比较丰富的植物，如苹果榕和高榕、半夏叶片等进行RNA提取时容易产生不溶物质和有色物质,导致产量和质量降低.而且这种方法步骤比较繁琐,耗时也较长,1次提取要2～4 d才能完成,增加了Rnase污染的机会,容易使RNA发生降解.因此使用范围较窄。 4. 热硼酸法 4.1 适用范围 香蕉果实、棉花等。 4.2 优缺点 热硼酸法原理是将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和LiC1选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。硼酸可与酚类化合物依靠氢键形成复合物，二硫苏糖 醇(DTT)作为还原剂，NP-40可阻止酚类物质氧化，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可与多酚化合物形成复合体，这些物质都可以抑制植物组织中酚类物质的氧化及其与RNA的结合，通过LiC1沉淀剩余的酚类物质，从而与RNA分开。因此热硼酸法所得产物纯度与产量都很高。 但所需时间长，操作复杂，操作一不小心会容易被外源RNase 降解使得产物完整性一般，且所需药品多，有些药品如蛋白酶K还很贵