生物化学--第十九章基因工程原理.ppt

Emphasis 基因工程的目的 技术流程 内切酶的特性和应用 基因克隆载体的要求 目的基因及导入方法 克隆子的筛选和鉴定方法 Content 基因工程 工具酶和DNA加工 基因克隆载体 目的基因及导入 克隆子的筛选和鉴定 研究进展与应用 1、基因工程 基因：是具有遗传功能的 DNA片段。基因组，某一个生物体染色体上的全部基因，包含生物体的全部遗传信息 基因工程：有目的地将某一生物体的遗传信息在体外经人工与载体相接，构成重组DNA分子，然后转入另一生物体细胞中，使被引进的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。 目　的：物种自然进化的速度太慢（自然条件下的进化力：基因突变、基因转移和基因重组等）。通过基因工程人为地极大提高生物体的进化速度，创造人类所需要的生物体（物种、生物学性能、蛋白质、酶、药物、化合物） 2、工具酶和DNA加工 基因工程的关键：DNA 的连接重组 必要性：DNA的连接之前必须进行加工－－将 DNA分子切割成所需的片段，同时将克隆载体进行相同的切割，以便于相互连接；可能还需对片段进行修饰。 DNA的切割方式： 物理破碎：针头拍打或超声波破碎成大约0.3-0.5 kb 碎片，缺点：随机切断DNA，不能重复。 限制性内切酶：1960’s，工具酶的发现， 来　源：是一类以环状或线型双链 DNA为底物，能识别特定DNA核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具 3‘-OH 和 5’ –P DNA片段的内切脱氧核苷酸酶 特　性：专一性 目　的：用于目标DNA与载体的连接、RFLP 类 型：I 型、II 型和III 型酶。实际使用 II 型酶,来源于细菌，数百种中常用仅有几十种 反应温度：37℃± 命 名：第一个字母为生产细菌属名的第一个字母，后两个字母为种名的前两个字母，罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出来的不同的限制性内切酶。 例　如：Hind II 表示从Haemophilus influenzae Rd中提取的第二种限制性内切酶。 识别特点：呈现碱基互补的特点；识别位点：4、6、8 bp，最常用的是 4 bp, 6 bp II型限制性内切酶根据切割后 DNA分子两条链断开后产生的末端不同分类: 粘性末端酶：两条链交错对称断裂，一条链 DNA多出1～N bp，成为凸出末端，又称粘性末端。 5’- DNA 凸出为5’-粘性末端，3’-端凸出的称之为 3’-粘性末端 平末端酶： DNA经限制性内切酶切割后，产生的DNA末端是平齐的，称平末端 5’-CTGCAG-3’ Pst I 5’-CTGCA-OH3’ + 5’P-G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G-P5’ + 3OH- ACGTC-5’ ? 识别位点 识别位点?  —C T C G A A G C T T G T T C— —G G C A A G C T T A C T— —G A G C T T C G A A C A A G— —C C G T T C G A A T G A— 　Hind III 酶解 Hind III 酶解? ?  —CTCGA-OH P-AGCTTGTTC— —GGCA-OH P- AGCTTACT— —GAGCTTCGA-P HO-ACAAG— —CCGTTCGA-P HO-ATGA— 混合、退火 ? —GGCAAGCTTGTTC— —CCGTTCGAACAAG— —A A G G C C G G G T C G— —G G A G G T T A A C C T— —T T C G G G C C C A G C— —C C T C C A A T T G G A— Sma I 酶解 Hpa I 酶解? ?  —AAGCCC-OH P-GGGTCG— —GGAGGTT-OH P-AACCT— —TTCGGG-P HO-CCCAGC— —CCTCCAA-P