研究生课程-分子生物学-专题篇.doc

3.专题篇 第十九章 基因诊断 基因诊断：以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在，结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。 基本原理：检测DNA或RNA的结构变化与否、量的多少及表达功能是否正常，确定受检者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病诊断的依据。 意义：不仅能对疾病作出早期和确切诊断，而且能确定个体对疾病的易感性及疾病的分期、分型、疗效监测、预后判断等。 基因诊断的技术方法 常用的分子生物学技术 核酸分子杂交 包括Southern blot; Northern blot; dot blot; in situ hybridization等 聚合酶链式反应（PCR） 常与其他技术联合应用 单链构象多态性检测（SSCP； single strand conformation polymorphism） 是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联用，称PCR-SSCP. PCR产物变性后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。 限制酶酶谱分析 限制性片段长度多态性（RFLP；restrict fraction length polymorphinsm） DNA序列测定 是进行基因突变检测最直接、最准确的方法，不仅可确定突变的位置，而且可确定突变的性质。 DNA芯片技术 实际上是一种快速、敏感、高效、自动化的核酸杂交技术 基因诊断的基本方法 特点: 1：特异性强检测特异性高达100% 2. 早期诊断 3. 灵敏度高 检测灵敏度达毫微微克(fg)水平 4. 取样方便 任一有核细胞均可作为检测样品 基因突变的诊断 点突变的诊断 已知的点突变 可采用PCR/ASO（等位基因特异性寡核苷酸；allele specific oligonucleotide）探针法检测。 未知的突变 PCR-SSCP； DNA序列测定； DNA芯片技术；等 少数核苷酸缺少或插入 探针法 大片段丢失或插入 PCR； 多重PCR（因为常规PCR扩增2kb 以上的片段比较困难） 基因重排（染色体易位） PCR； 原位杂交（包括FISH）； 基因扩增 Southern blot（先用酶切，再作blot） 多态性分析 RFLP分析 限制酶酶谱直接分析法 RFLP间接分析法 DNA重复序列多态性分析 基因表达异常的诊断 mRNA相对定量分析 斑点或狭缝杂交 RT-PCR mRNA绝对定量分析 RT-PCR/竞争性PCR mRNA长度分析 Northern blot 外源DNA检测 血清学等方法不够灵敏或特异，考虑用核酸分子杂交或PCR等技术，应用基因特异性探针或合成特异的寡核苷酸引物来检测。 肿瘤的基因诊断 肿瘤基因诊断的策略 检测肿瘤相关基因 检测肿瘤相关病毒的基因 检测肿瘤标志物基因或mRNA 第二十章 基 因 治 疗 基因治疗 一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。 基因治疗的主要策略 基因置换（gene replacement)或称基因矫正（gene correction）：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。 基因添加或称基因增补（gene angmentation）：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。 基因干预（gene interference）：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。 基因置换或基因添加的必要条件 对导入的基因及其产物有详尽的了解 外来基因能有效地导入靶细胞 导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留 导入基因能有适度水平的表达 基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害 导入自杀基因－－细胞自杀效应 将自杀基因转移入宿主细胞中，该基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞“自杀”，清除肿瘤细胞。 基因修饰－－改变细胞功能 基因修饰肿瘤细胞的“疫苗”疗法 基因修饰TIL的过继免疫方法 免疫增强基因疗法 原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法 基因标记（gene labeling）：基因标记实验是基因治疗的前奏，并不在于直接治疗疾病而是期望能够提供有关正常细胞生物学和疾病病理方面的信息。 基因治疗基本上涉及三步 基因导入（administration）：把基因或把含有基因的载体导入机体。 基因传递（delivery）：基因从导入部位进入靶细胞核。 基因表达（expression）：细胞中治疗性基因产物的形成。 理想的基因治疗载体具备的性质 易于进入靶细胞。 在特异细胞或组织达到