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神经生物学常用研究方法 王海萍 (histologyw@163.com) 安徽医科大学神经生物学教研室 神经科学的兴起 百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(I) 百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(II) 神经科学的特点 多学科综合 神经科学的特点 多层次的研究 研究水平 整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听觉，痛觉等　　 细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测 分子水平的实验：离子通道、受体、酶、遗传物质等 神经生物学常用研究方法 神经影像（Neuroimaging） Choice of the Methods Choice of the methods depends on the scientific question being asked. For neuronal activity, at a cellular level, use single- or multi-unit recording. For questions of structure, use CT or MRI. For questions of function, or system interactions, where the anatomy is of interest, use PET or fMRI. For questions of processing, where timing is important, use ERP and/or MEG. Single- Multi-unit Recording Positron Emission Tomography (PET，正电子发射计算机断层显像) CT or CAT scan(Computed Tomography) 组织学与细胞学 常规染色和特殊染色 束路追踪 免疫组化 原位杂交 神经细胞培养等 常用普通染色方法 TTC染色 HE 锇酸染色 氯化金浸染 Cajal银浸染色 尼氏染色 HE（苏木素－伊红） 锇酸染色 氯化金浸染 Cajal银浸染色 尼氏染色 多种方法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺染料均可以使尼氏体着色 束路追踪 原理：轴浆运输 示踪物质：HRP，荧光染料，各种标记物标记的葡萄糖，放射性核素标记的氨基酸等。 观察：根据示踪物质不同，采用组织显色、荧光显微镜或放射自显影等方法。 免疫组化 原理示意图： 间接法： 直接法： 免疫组化 根据二抗标记的不同（荧光素、酶、铁蛋白、胶体金或银标记），免疫组化包括免疫荧光、免疫酶组织化学、免疫金银及铁标记技术 原位杂交 核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。 原位杂交 此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：①利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA)；②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA)；③依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。 cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。 原位杂交 组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达。 核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究的重要手段。 生理学方法 最常用的有两种 神经行为学 电生理学 一、神经行为学 Behavioral neuroscience is the study of the neural mechanisms mediating normal and abnormal behaviors. 自主活动 动物焦虑检测：实施焦虑因素，如饮食或饮水剥夺，检测反应，可以用于药物筛选。 性和生殖行为：进化，神经内分泌作用机制 学习记忆 摄食行为 惊恐反射 社会行为 …….. 自主活动箱实验 动物的自主活动标志着动物中枢神经系统的兴奋状态，当中枢神经系统兴奋