第4章基因组分析策略和技术.ppt

第 4 章 基因组分析策略和技术 三 大规模测序的策略 工作框架图与精细图 工作框架图: 目的：获得基因组的基本结构信息（如GC组成、重复序列）、基因的识别和功能分类、SNP的发现等 测序量：4－5倍基因组大小的覆盖度 序列覆盖率：90%以上，准确度不低于99% 。 精细图 目的：对重要功能基因及调控序列进行精确的染色体定位，为基因的功能研究奠定基础 测序量：8－10倍基因组大小的覆盖度 序列覆盖率：99%以上，序列准确度不低于99.99％。 2 全基因组霰弹法与逐步克隆法 全基因组霰弹法 （Whole Genome Shot-gun) 逐步克隆法 （Clone by Clone） 全基因组霰弹法 霰弹法(Shot-gun)，亦称“鸟枪法”，用于全基因组 随机测序 方法：借助物理或化学手段，将整个基因组随机 打断成一定大小的片段进行测序，再根据序列间 的重叠关系进行计算机排序和组装，确定它们在 基因组中的位置 优点：速度快，简单，成本较低 缺点：序列的拼接组装比较困难，在重复序列较 多的区域难度更大 逐步克隆法 以物理图谱为基础、以大插入片断克隆为单位的定向测序策略 方法：构建以染色体为单位的遗传图谱，再利用高覆盖度的大片段基因组文库(BAC、PAC等)获得精细的物理图；选择合适的BAC或PAC克隆进行亚克隆测序，得到一条完整的BAC序列；参照物理图谱，将相互关联、部分重叠的BAC克隆连成一个大的重叠群(Contig)。 优缺点： 技术难度较高，尤其是大片段基因组文库和 精细物理图谱的构建技术性极强； 费用高、费时 A 物理图谱的制作 遗传图谱是根据DNA重组原理，用遗传学距离来排定含有插入片段克隆群次序的图谱，它所显示的是基因组内基因与专一的多态性DNA路标（Marker）的相对位置 物理图谱是直接检测DNA标记在染色体上实际位置的图谱，是把克隆群中的DNA片段按其在基因组上的实际物理位置进行排序 a. 物理图的种类 主要有以下四类： 限制性作图（Restriction Mapping）: 描述以稀有酶切位点为生物学界标的顺序和距离，形成基因组或染色体区域上的酶切图谱 可把DNA定位在100kb-1Mb范围内 荧光标记原位杂交作图（Fluorescent in situ Hybridization, FISH）: 使用荧光原位杂交技术确定含有路标的DNA片段在染色体上的区带位置与分布 DNA片段可被定位在2-10Mb的范围内 依靠重叠克隆群的基因组作图（Clone-based Mapping）: 根据克隆之间的重叠顺序构建重叠群（Contig），绘制物理连锁图 通过粘粒重叠克隆群把DNA定位在小于2Mb的范围内 序列标签位点作图（Sequence Tagged Site, STS）是从基因组上筛选特异序列作为路标 平均100kb一个 “反应池”方法 将待筛文库中的克隆分别保存于96孔保菌板中，每孔为一个单克隆 每组“反应池”：即由1个“超级池”、8个“板池”、8个“行池”和12个“列池”所组成。 以8板为单位将96孔板分成若干组，每组中，所有克隆混合组成1个“超级池”（Super Pool）， 每板的克隆分别混合组成8个“板池”（Plate Pool）, 8个板的各行、列克隆分别混合组成8个“行池”（Row Pool）和12个“列池”(Column Pool)。 筛选：通常分三轮进行 第一轮，对所有组的“超级池”进行PCR，筛选出阳性“超级池” 第二轮，对含有阳性“超级池”的组内的“板池”、“行池”和“列池”进行28个PCR扩增，根据各板、行、列的阳性结果进行三维交叉定位，得到若干个候选克隆 第三轮，随机选取几个候选克隆，进行PCR扩增，挑出STS的阳性克隆 phred 读取程序： 实现碱基识别和错误率估算，生成*.phd文件 phd2fasta 转化程序： 将*.phd文件转化为FASTA格式的*.seq , *.seq.qual的文件 cross_match 载体标记程序： 将*.seq文件中的载体顺序标记为X phrap 拼接程序： 拼接各短片段，并进行质量评估 consed 校对程序： 查看拼接结果，并结合人工校对 *.seq.qual文件 203c04_0