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第7章第3节分子诊断技术介绍 分子诊断 定义：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而作出或辅助临床诊断的技术，又称基因诊断。 分子诊断学的发展 简悦威(YW Kan): RFLP检测单碱基突变(βS) 遗传标记：RFLP、STR、SNP 人类基因组计划 技术方法的层出不穷，仪器设备的目新月异 PCR-RDB(Reverse Dot Blot)技术快速产前基因诊断β地贫点突变 特点：同时筛查多种突变,结果准确可靠。 PCR-RFLP for Prenatal Diagnosis Detection of Unknown Mutations 流感病毒核酸RT-PCR检测 明确待检病原体的遗传物质构成 流感病毒 RNA 登革热、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒 RNA HCV、HIV RNA 轮状病毒、诺如病毒等致腹泻病毒 RNA HBV、腺病毒、立克次体 DNA 病原菌 检测基因组DNA和质粒DNA RNA病毒需用Reverse transcription(反转录）PCR来进行检测。 1、RT-PCR实验推荐试剂 宝生物工程（大连）有限公司 PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2 (一步法RT-PCR试剂盒)；货号：DRR055A 宝生物工程（大连）有限公司 One Step PrimeScript RT-PCR Kit (一步法荧光RT-PCR试剂盒)；货号：DRR064A 2、一步法RT-PCR实验原理 Protocol for establishment of microorganismsspecific molecular detection method 荧光化学原理 SYBR Green I ? TaqMan? / TaqMan-MGB? Molecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux? primers ScorpionsTM Amplifluor Q-Zyme FRET SYBR Green I 荧光染料特点 原理和方法FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基团FAM（荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（荧光发射峰值在582nm处），探针的3’端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来.模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。 Taqman 探针特点 荧光定量PCR常用概念要义 （2）实时RT-PCR检测新型甲型H1N1流感病毒 方法： 国家CDC流感中心提供（美国CDC建立） SEQUENCING Classical Sequencing Gel Reading Classical Sequencing Gels PCR常见问题与对策 PCR常见问题之一 无扩增产物 PCR常见问题之二 PCR常见问题之三 PCR常见问题之四 1) 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外，用带滤芯的枪头； 2) 除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。 3) 各种试剂先进行分装，低温贮存。 (1) 模板间交叉污染 (2) PCR试剂污染 (3) 实验室中克隆质粒的污染 (4) 合理分隔实验室 (5) 移液枪不能接触PCR相关试剂 (6) 手套、吸头、小离心管一次性使用 (7) 设阳性、阴性和空白对照，重复实验 4、基因芯片技术 特点：微量化、大规模、高通量、自动化分子检测技术 基本原理：基于核酸分子杂交技术,高密杂交 基本过程：芯片制备，靶分子扩增，杂交，洗涤，检测 相关名词： 生物芯片 Biochip, Bioarray, Biomicrochip 微阵列技术 Microarray-based technology DNA芯片 DNA chip, DNA array, DNA microa