第三章 高效液相色谱法09.ppt

第三章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) §3－1 高效液相色谱法的特点 一、概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进。目前已成为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 HPLC的特点： “三高” “一快” “一广” HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。 涡流扩散　A=2λdp 球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。 纵向扩散　B=2γDm 可以忽略。 因为Dl很小，室温操作，且u大于u最佳 (二) HPLC法中提高分离效率的措施 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1mL/min 3. 柱温的选择： 选室温250C左右 §3－3 高效液相色谱法的类型 及其分离原理 液液分配色谱 （LLPC） 化学键合相色谱(CBPC) 液固吸附色谱(LSAC) 离子交换色谱(IEC) 离子对色谱(IPC) 离子色谱(IC) 尺寸排阻色谱(SEC) (凝胶色谱法 Gel C) 亲和色谱(AC) （四）离子色谱法（IC） 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，因有些被测离子不能采用紫外检测器，若采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。 因此，就在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。 当试样经阳离子交换剂的分离柱后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应： R+－OH＋H+Cl- →R+－Cl+H2O R+－OH-＋M+Cl-→M+OH－＋R+－Cl- 由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理，也是水溶液中阴离子分析的最佳方法。 （五）离子对色谱法（IPC） 1．分离原理 离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。 离子对形成机理：假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子A-相反的离子B+，B+离子由于静电引力与带负电的组分离子生成疏水性离子对化合物A-B+。 由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对疏水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不