第五章微生物酶的工业提取.ppt

第五章 微生物酶的工业提取 酶分离纯化的基本原则 1.防止酶变性失效 （1）一般在低温下进行 （2）控制pH不要过酸、过碱 （3）尽量减少泡沫 （4）防止重金属、有机溶剂引起酶变性，防止微生物污染和蛋白酶水解。 2.选择有效的纯化方式 （1）在不破坏待纯化酶的限度内，使用各种“激烈” 手段。 （2）使用亲和剂进行纯化。 3.酶活性测定贯穿纯化过程始终。 微生物酶制剂工业提取的一般步骤 胞内酶：分离收集菌体－破碎－抽提 胞外酶：深层培养液或固体培养的抽提液 离心或过滤－去杂－浓缩－沉淀分离（盐析、有机溶剂沉淀等）－干燥－加工不同剂型产品 第一节 酶抽提液的制备 一、胞内酶的抽提液 二、深层培养液（或抽提液）的过滤 三、酶抽提液的去杂 一、胞内酶的抽提液 （一）胞内酶在细胞内分部概况 （二）细胞破壁方法 （三）破碎检查 （一）胞内酶在细胞内分部概况 1.在细胞壁内，游离在细胞浆里与外围细胞浆里。 2.牢固结合在细胞器或细胞膜上。 （二）细胞破壁方法 1.机械法 2.物理法 3.化学法 4.酶解法 1.机械法 通过机械切力的作用使细胞组织破碎的方法。 如：高压匀浆器的挤压冲击。 2.物理法 通过物理作用使细胞组织破碎的方法 （1）反复冻融法 （2）冷热交替法 （3）超声波振荡法 3.化学法 （1）丙酮干燥法 （2）表面活性剂处理 4.酶解法 （1）自溶法 （2）溶菌酶法 （三）破碎检查 1.直接测细胞破碎 2.测释放出的蛋白的量 3.测酶活力 二、深层培养液（或抽提液）的过滤 （一）添加絮凝剂 （二）添加凝固剂（沉淀剂） （三）添加助滤剂 （四）提高温度处理 （一）添加絮凝剂 1.为何进行絮凝处理 2.絮凝作用原理 3.常用絮凝剂 1.为何进行絮凝处理 酶的发酵液是一种胶体溶液，固液分离比较困难，原因是： （ 1 ）细菌细胞微小 （ 2 ）细胞表面带有负电荷 （ 3 ）-COOH、-NH2、-OH等各种基团形成水化层 2.絮凝作用原理 絮凝剂中和了悬浮粒子表面的电荷，与胶体粒子表面基团之间形成架桥絮凝。 3.常用絮凝剂 （1）无机絮凝剂 （2）有机絮凝剂 三、酶抽提液的去杂 （一）阳离子沉降除杂 （二）表面活性剂沉淀除杂 （三）无机盐凝胶沉淀除杂 四、酶抽提液的浓缩 （一）真空低温蒸发浓缩 （二）超过滤浓缩 第二节 酶的沉淀方法之一：盐析法 酶（蛋白质）的沉淀：添加某些试剂或者改变某些环境条件，致使酶（蛋白质）离开溶液，形成不溶性颗粒的过程。 盐析：蛋白质在高浓度的中性盐溶液中沉淀析出。 一、盐析的基本原理 二、盐析剂中性盐的选择 三、盐析剂用量的确定 四、分部盐析法 一、盐析的基本原理 1.酶蛋白溶液是稳定的亲水胶体 2.盐析的基本原理 3.盐析过程 二、盐析剂中性盐的选择 盐析常用的中性盐：硫酸铵最常用。 原因： （一）溶解度大 （二）温度系数小 （三）盐析效果好 （四）来源容易，价格便宜 三、盐析剂用量的确定 例：以硫酸铵盐析糖化酶 四、分部盐析法 1.分部盐析法 2.盐析曲线 3.两种酶的分离 第三节 酶的沉淀方法之二：有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀蛋白质的原因： 1.有机溶剂加入酶溶液会使溶液的介电常数降低 2.有机溶剂加入酶溶液可能会破坏酶或蛋白质中的某些键，导致疏水基团外露，形成疏水层。 一、有机溶剂的选择 二、有机溶剂用量的确定 三、温度对有机溶剂沉淀酶的影响 (一)温度低沉淀完全 (二)温度升高，已沉淀的蛋白质可能复溶 (三)温度降低，原先溶解的蛋白沉淀，影响酶纯度 (四)有机溶剂与水混合会放出大量的热，使酶液温度升高 四、实例 有机溶剂沉淀法制取食品级α-淀粉酶 第四节 液体浓缩酶和酶的干燥 一、液体酶制剂的制备 二、酶的干燥 一、液体酶制剂的制备 （一）液体酶的制造： 发酵液经过滤－除杂－浓缩后，添加防腐剂和稳定剂－成品 （二）液体酶的保存 1.添加防腐剂 2.添加稳定剂 二、酶的干燥 （一）冷冻干燥 （二）直接干燥 （三）喷雾干燥 （一）冷冻干燥 （二）直接干燥 工业粗酶可用烘箱、烘房直接干燥，但注意温度不能太高。 （三）喷雾干燥 * * 糖化酶的盐析曲线 工艺流程说明： 1.发酵液预处理 2.压滤 3.浓缩 4.沉淀 5.压滤 6.干燥