小鼠肝脏rna的抽提纯化与鉴定知识讲稿.ppt

* 实验目的 掌握RNA操作注意事项 了解鉴定RNA含量和质量的方法 了解RNA抽提原理 熟悉RNA抽提方法 实验原理 理论基础: 真核生物结构基因有内含子 基因在转录水平的表达 实验原理:四步骤 组织或细胞匀浆 分离总RNA 纯化RNA 检测RNA的纯度及完整性 理论基础 真核生物中绝大多数基因有内含子,如直接由基因组克隆目的基因,不利于编码基因的序列分析及体外利用原核细胞表达。提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主要手段。 检测基因在转录水平的表达,需检测mRNA含量,定量RT-PCR是主要方法之一。 RNA电泳结果示意图 28S 18S 5S RNA电泳结果凝胶成像图 28 S 18 S 5 S 取小鼠肝组织匀浆 处死小鼠 匀浆 取肝50~100g Trizol 1ml 匀浆 RNA纯化操作步骤 加入氯仿0.2ml,剧烈振荡,室温放置10分钟。12000rpm离心15min,取上清。 (离心后溶液分为三相,即上层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白。小心吸取上层水相,绝不能有中层蛋白混入。) 加入异丙醇0.5ml,振荡混匀,室温放置10分钟,12000rpm离心10min,弃上清。 (加入50％的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当。) 1ml 75％乙醇洗涤沉淀,12000rpm离心5min,重复一次。 空气干燥沉淀,溶解于20μl DEPC-H2O。留样2μl,其余－70℃保存备用。 RNA电泳操作步骤 制备琼脂糖凝胶:首先将0.5g琼脂糖溶化于32ml水,冷却至60℃。加入5×甲醛变性凝胶电泳缓冲液10ml,37％甲醛水溶液9ml,混合均匀并灌制胶板。 取1μl RNA溶液,加入甲酰胺-上样缓冲液9μl,95℃变性5分钟,迅速冰浴冷却。点样。 150V电泳30分钟,紫外灯下观察电泳结果。