PCR步骤-打印版.doc

RNA提取 1）将组织从液氮取出，加入2ml离心管中，尾组织加入一颗氧化锆的小珠。 2）加1mL trizol，使用组织破碎机进行匀浆，30Hz，2min。 3）匀浆后的组织液在孵育5min。 4）组织液加入200μL三氯甲烷，冰浴3min。 5）以12000rpm的速度离心15（4），可见蛋白沉淀。 6）取μL上清液移入装有μL的 100%异丙醇的1.5ml离心管。 7），冰浴10min 8）12000rpm离心10分钟（4），离心管底部可见白色RNA沉淀。 8）弃上清，加1mL 75%的乙醇，。 9）7400rpm离心min（4），弃上清。 10）简短离心，用吸出残余乙醇，室温晾干3-5min。 11）待RNA晾至半透明，加入无RNA酶的水。 11）55水浴10min并涡旋，使RNA完全溶解。反转录 取1uLRNA，用紫外分光光度法测其浓度。 在1.5mL离心管中涡旋混匀如下试剂，简短离心后分装至PCR管中μL反应体系，可相应按照比例调整）： 10×RT Buffer 2μL Oligo dT 2μL dNTP 2μL Quant Reverse Transcriptase 1μL RNA =1000/RNA浓度 RNase-free H2O =13-RNA体积 涡旋混匀，简短离心后进行反转录37℃ 1h 94℃ 3min 4℃ 保存 备注：测RNA浓度需要携带： RNA 移液枪（0.1-2.5，5-50μL） 擦镜纸 枪头 RNase-free H2O U盘  PCR操作步骤 25/ 20 μL反应体系，可相应按照比例调整：μL反应体系 20 μL反应体系 2* Taq PCR Master Mix 12.5μL 10 cDNA 2μL 1.6 RNase-free H2O 8.5μL 6.8 Primer-Forward 1μL 0.8 Primer-Reverse 1μL 0.8 备注：RNase-free H2O和cDNA体积可以根据扩增结果调整！ PCR扩增条件EF 94 (C预变性2 min，94 (C 45 s，60(C 45 s，72 (C 45 s， 共个循环，然后72 (C延伸10 min。94 (C预变性2 min，94 (C 4 s，6(C 40 s，72 (C 4 s， 共个循环，然后72 (C延伸10 min。TRβA 94 (C预变性2 min，94 (C 45 s，67(C 45 s，72 (C 45 s，共30个循环，然后72 (C延伸10 min；94 (C预变性2 min，94 (C 4 s，6(C 40 s，72 (C 4 s， 共个循环，然后72 (C延伸10 min。μL EB 备注：点样量一般为5μL，具体应根据扩增实际效果调整！ 才干+实干=成功