HPLC测定饲料中中盐酸麻黄碱含量.docx

高效液相色谱法测定饲料中麻黄碱含量麻黄中的主要成分为麻黄碱，建立HPLC法测定饲料中盐酸麻黄碱含量测定方法。采用Kromasil-C18色谱柱，乙睛-0.1%磷酸溶液（含0.1%三乙胺）（3∶97），流动相流速为1.0 ml.min-1；检测波长为207nm。麻黄硷进样量在0.406-1.596ug 范围内具有良好的线性关系（r＝0.9999.n=5）.平均加样回收率为98.9%，RSD=0.80%。1 仪器与试药1.1 仪器 高效液相色谱仪（美国戴安公司）P680泵，DIONX UVD170U紫外检测器， DT-230A柱温箱，变色龙CHROMELEON色谱工作站；HS3120超声波处理器；梅特勒AD135电子天平。1.2 试药甲醇为色谱级；其他试剂为优级纯；葛根素对照品盐酸麻黄碱批号（中国药品生物制品检定所，纯度为100%）；劲益健（北京中农劲腾生物技术有限公司产品）。2 方法与结果[1-5]2.1 色谱条件色谱柱为Kromasil-C18 (4.6 mm×250mm,5um)；流动相为乙睛-0.1%磷酸溶液（含0.1%三乙胺）（3∶97）；检测波长为207nm。柱温为25℃；流速为1.0 ml.min-1 ；进样量：20μl。盐酸麻黄碱的保留时间约为16分钟。2.2 供试品溶液与阴性溶液的制备2.2.1 提取方法的选择：2.2.1.1 参考本品原含量测定样品萃取方法：精密量取本品10g，置分液漏斗中，加浓氨溶液1ml使成碱性，用乙醚-乙醇（8：2）混合液提取至无生物碱反应，用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液置蒸发皿中挥干乙醚，残渣加甲醇使溶解，定量转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。结果：被测峰分离效果不好。2.2.1.2 参考麻黄药材含量测定法精密量取本品10g，加浓氨试液3ml、乙醇10ml与乙醚20ml，加乙醚置水浴上加热回流4小时，至生物碱提尽，将提取液移置分液漏斗中，容器用少量乙醚洗涤，洗液并入分液漏斗中，加0.5mol/L盐酸溶液振摇提取5次（20ml、10ml、10ml、10ml、10ml）合并酸液，滤过，滤液加氢氧化钠试液使呈碱性，加氯化钠饱和，用乙醚振摇提取5次（20ml、10ml、10ml、10ml、10ml），合并乙醚液，用氯化钠饱和溶液洗涤3次，每次5ml，合并洗液，再用乙醚10ml振摇提取，合并乙醚液，挥干乙醚，残渣加甲醇使溶解，定量转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。结果：被测峰拖尾，被测成分提取不完全，含量很低。2.2.1.3盐酸麻黄碱含量测定法，用乙醚振摇提取。精密量取本品5ml，加水10ml及浓氨试液0.5ml，用乙醚提取5次（30ml，30ml，20ml，20ml，20ml），合并乙醚液，加盐酸乙醇溶液（1→20）2ml，混匀，低温回收溶剂至干，残渣加乙醇5ml使溶解，转移至25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。结果：被测峰分离度大于1.5，理论板数均在4000以上。2.2.2提取次数的选择：取本品，分别精密量取同一批号的四份样品各5g，分别加水10ml及浓氨试液0.5ml，用乙醚提取3次、4次、5次、6次（每次20ml），合并乙醚液，加盐酸乙醇溶液（1→20）2ml，混匀，低温回收溶剂至干，残渣加乙醇5ml使溶解，转移至25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。按上述选定的色谱条件，分别取各供试品溶液10μl，注入液相色谱议中，测定其含量，结果见表1。表1 不同提取次数含量结果比较表提取次数3次4次5次6次盐酸麻黄碱含量（mg/ml）样10.0990.2070.2360.236样20.1040.2150.2380.238以上结果表明，样品经乙醚提取5次，盐酸麻黄碱的含量不再增加，说明盐酸麻黄碱已提取完全，因此，样品提取次数定为5次。2.2.3提取溶剂数量的选择：取本品，分别精密量取同一批号的三份样品各5g，分别加水10ml及浓氨试液0.5ml，用乙醚提取5次100 ml、120 ml、 150 ml（20ml，20ml，20ml，20ml，20ml）、（30ml，30ml，20ml，20ml，20ml）、（30ml，30ml，30ml，30ml，30ml）合并乙醚液，加盐酸乙醇溶液（1→20）2ml，混匀，低温回收溶剂至干，残渣加乙醇5ml使溶解，转移至25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。按上述选定的色谱条件，分别取各供试品溶液10μl，注入液相色谱议中，测定其含量，结果见表2。表2 不同提取含量结果比较表溶剂数量（ml）100120150盐酸麻黄碱含量（mg/ml）样10.1890.2360.236样20.2010.2370.238以上结果表明，样品经乙醚提取5次，用