分子病理学技术.ppt

分子病理学技术及其应用 南京大学医学院附属鼓楼医院病理科 王景美 分子病理学定义 由分子生物学、医学遗传学和病理学相结合所形成的交叉学科。 研究基于体细胞基因突变及其产物异常的疾病，研究它们的发生和发展机制。 应用分子生物学和分子遗传学的原则、理论和技术来确诊遗传性疾病、发育异常性疾病、感染性疾病和恶性肿瘤，从而阐明这些疾病的自然史，并为临床医生提供与治疗有关的信息。 借用遗传学、基因组学和蛋白质组学所创建的方法，在DNA、RNA和蛋白质三个层次来实现。 分子病理学与传统病理学的区别 分子病理学的发展 1990年人类基因组计划的成功实施使得医学进入了分子时代。 上世纪九十年代，分子生物学理论和方法引进病理学，形成了分子病理学。 近年来，FISH、感染原的PCR诊断、基因重排等分子诊断技术，已从实验室研究走向临床实际医疗工作。 国内尚处于起步阶段。 分子病理学常用技术 PCR及原位PCR技术 原位杂交 (ISH)及荧光原位杂交 (FISH) 限制性核酸内切酶片断长度多态性分析(RFLP) 基因突变分析和核酸序列分析 生物芯片 PCR基因诊断技术 核酸化学---组成与结构 核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，分核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两种 DNA主要存在于细胞核染色质中，携带遗传信息；RNA主要存在于细胞质中(90%)，参与细胞内遗传信息的表达 构成核苷酸的碱基主要有五种：A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。 DNA为一反向平行的互补双链结构，碱基互补配对（A=T, G ?C) 核酸化学---理化性质 一般理化性质 变性：DNA分子中的两条链分开形成单链的过程 复性：分开的单链分子按照碱基互补原则重新形成 双链的过程 中心法则---决定生命的法则 DNA是自身复制的模板 DNA通过转录作用将遗传信息传递给中间物质RNA RNA通过翻译作用将遗传信息表达成蛋白质 PCR技术原理及特点 PCR基本原理 PCR技术的发明及发展 1985年Mullis教授发明了PCR技术 PCR技术首先应用于人?-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断 PCR技术在短短几年内广泛应用于分子生物学、微生物学、遗传学等生物学的各个领域 1988年PCR技术在我国开展 PCR技术的特点 敏感性高 特异性强 快速、简便 可扩增RNA或cDNA 存在的一些问题 几种常用PCR技术类型 二温式PCR 逆转录PCR（RT-PCR) 巢式或套式PCR（Nested PCR) 多重PCR（Multiplex-PCR) 定量PCR 不对称PCR（asymmetric PCR) 其它 PCR技术主要仪器设备 离心机 PCR仪 电泳装置 紫外分光光度计 其他：超纯水制造系统、计量仪器、 通风设备 操作程序 标本的来源及取样 组织标本：新鲜组织标本或冰冻组织、石蜡包埋组织、脱落细胞 体液及排泄物：全血、血清、唾液、尿液、胸水、腹水、羊水、生殖道分泌物等 细菌培养物 DNA模板的制备 DNA沉淀 常用DNA模板制备方法 酚－氯仿提取法 加热法 碱变性法 表面活性剂裂解法 PCR扩增体系的基本成分 引物 Taq DNA聚合酶 10 ? PCR缓冲液 MgCl2 4?dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 模板DNA 其他 PCR条件的优化 引物 Mg2＋ 温度循环参数 其他 PCR扩增产物的分析 琼脂糖凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 注意事项 预防污染：隔离不同操作区、分装试剂、改进实验操作、结果的重复性 污染源的追踪：设立阳性及阴性对照、选择合适引物、环境污染 污染的处理：稀酸处理法、UV照射法 PCR技术的临床应用 病原体检测 遗传性疾病的基因诊断 肿瘤基因的检测 PCR技术检测病原体 病毒检测： 肝炎病毒、HIV、HPV、 HSV 、 CMV等 细菌检测： 肠道致病菌、呼吸道致病菌、脑膜炎双球菌、林球菌等 其他病原体： 寄生虫、衣原体、支原体、梅毒螺旋体等 PCR技术在遗传性疾病诊断中的应用 地中海性贫血（?珠蛋白基因突变或缺失/?珠蛋白基因突变） 镰状细胞性贫血（?珠蛋白基因突变） 苯丙酮尿症 血友病 其他：视网膜色素变性、先天性肾上腺皮质增生 PCR技术检测肿瘤基因 基因重排 癌基因检测：Ras, C-myc, CerbB2 抑癌基因检测: p53, APC, BRCA 原理 正常造血细胞向B或T淋巴系定向分化时，发