二碱性磷酸酶的比活性测定.PPT

 酶的提取纯化过程中应该注意哪些问题？如何评价酶的提取与纯化成功与否？ 测定酶的比活性有何意义？ 测定蛋白质含量的方法 * 操作步骤见上。 * 结果记录与分析 * 实验内容：酶的提取及比活性测定 加入有机溶剂计算公式如上 磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性， 37℃保温15分钟产生1mg酚者为1个酶活性单位。 2. 蛋白质含量测定 测定样品的比活性必须测定包括：每毫升样品中的酶活性单位数，每毫升样品中的蛋白质毫克数。 目 录 目 录 综合性实验 酶学实验 酶的提取及比活性测定 酶的本质是蛋白质，其提纯方法常用分离纯化蛋白质的方法 原料要求：新鲜、酶含量丰富 来源：体液（直接提取）、组织（先破碎） 匀浆+低渗 方法：盐析、有机溶剂、层析、电泳 先粗后细、多法配合 保护酶的活性 pH 酶的最适pH不一定是酶的最稳定pH 温度 一般低温，个别例外（如丙酮酸羟化酶0℃不稳定，26 ℃稳定），防止反复冻融。 氧化 防止必需基团中游离巯基的氧化（β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇） 重金属离子 （EDTA乙二胺四乙酸） 蛋白酶污染 细胞破碎时溶酶体释放大量酶类（低温、蛋白酶抑制剂） 介质的极性和离子强度 根据酶的性质选择介质（蔗糖、甘油可提高疏水环境；KCl、NaCl、NH4Cl等提供高离子强度介质） 检测酶提取纯化的指标 酶的纯度： 用比活性代表（单位重量蛋白质样品中 所含酶的活性单位） 酶的回收效率 ※在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的回收率 实验内容 酶的提取及比活性测定 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)的分离纯化及比活性测定 [目的] 1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注意事项 2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。  [原理] 机械破碎法制备肝匀浆 匀浆液 低浓度醋酸钠：低渗破膜 低浓度醋酸镁：保护和稳定AKP  有机溶剂沉淀法分离纯化AKP 加入不同有机溶剂，重复离心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质 33％丙酮(30％乙醇)：AKP溶解  50％丙酮(60％乙醇)：AKP不溶解  (一)碱性磷酸酶的分离提纯 [操作步骤] 25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液） A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性 A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度 +2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （3000rpm)5min 下清液（吸取） 沉淀（弃） +等体积丙酮，离心（2000rpm)5min 上清液（弃） 沉淀 +0.5M醋酸镁2ml溶解（B液） [操作步骤] B 液 +95%冷乙醇至30%，离心（2500rpm）5min 上清液（吸取） 沉淀（弃） + 95%冷乙醇至60%，离心（2500rpm）5min 上清液（弃） 沉淀 +0.01M 醋酸镁-醋酸钠2ml,溶解（C液） C1：取0.1mlC液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性 C2：取0.1mlC液+0.1ml生理盐水，待测蛋白浓度 B1：取0.1mlB液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性 B2：取0.1mlB液+0.9ml生理盐水，待测蛋白浓度 加入有机溶剂计算公式 设加入Xml95%乙醇 ※至终浓度30% 30%（B液体积+X）=95%×X X=30%B液体积÷95%-30%=0.462B液体积 ※至终浓度60% 60%（上清液体积+X）－30%上清液体积=95%X X=（60%-30%）上清液体积÷ 95%-60%=0.867上清液体积 [注意事项] 各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。 操作要在低温下进行。 加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。 加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应及时离心。 离心析出的蛋白质沉淀应立即溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。 (二