分子生物学 第11章 分子生物学研究方法介绍.ppt

第十三章 分子生物学研究方法;教学目的、要求;主要内容;第一节 DNA分子克隆概述;DNA克隆(DNA clonging) ： 是按人类的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 四大要素：基因、载体、受体、工具酶 又称为：DNA重组、分子克隆、基因克隆、基因工程等。 ;一、基本概念;;基本过程;第二节 DNA分子克隆的四大要素;一、分子克隆工具酶;1. 限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶的分类和命名;(3)命名：根据酶的微生物学名命名： 如：Escherichia coli, R株中几种限制酶： EcoR I，EcoR II，EcoR V;　; GAA TTC CTT AAG ;5‘-cohensive end or stick 以EcoR I为例;CTGCA G;TCG CGA;R-M 系统;(5) II型限制性内切酶的用途： DNA克隆 DNA杂交与序列分析 改建质粒 构建基因组图谱和文库 ; (1) 性质：催化两个独立DNA片段的5’－磷酸基与3’－羟基之间形成磷酸二酯键，使DNA片段拼接起来，只对双链起作用，对单链不起作用;(2)DNA连接酶的种类;互补粘末端的连接;平末端的连接;3、 DNA聚合酶;4. 其他分子克隆工具酶;(1) 末端脱氧核苷酸转移酶;;; (2) T4多核苷酸激酶;;(3) 碱性磷酸酶;;二、分子克隆载体;1. 概 述;基因克隆载体应具备的条件： 必须含有允许外源DNA片段组入的克隆位点，并且克隆位点应尽可能的多，具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有合适的筛选标记 必须是安全的 载体的分子量要小 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性 ;;载体的类型 来源: 质粒、噬菌体、病毒、酵母人工染色体 功能: 克隆型载体和表达型载体 受体细胞: 原核细胞载体和真核细胞载体 (穿梭载体);2. 质粒plasmid;(1) . 双抗生素抗性;;当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。;四环素抗性插入失活;;(2) 蓝白斑筛选;lacZ基因互补显色筛选;pUC18/19;通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。;Shuttle vectors 穿梭载体;三、受体细胞;常用的受体细胞 原核生物细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌 真核生物细胞：酵母、植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞 ;四、目的基因;获得目的基因的途径;第三节 DNA的克隆;二、DNA的体外重组; X if the vector is phosphoralated;The use of alkaline phosphate to prevent religation of vector molecules 碱性磷酸酶可以阻止载体分子自我环化;(二) 连接方法;CCGG GGCC;CGG C;plasmid vector;dCTP;poly G; 粘性末端修饰成平末端后进行连接;GGATCC;GGATCC;G;重组DNA导入的方法 化合物诱导转化法 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 聚乙二醇 电穿孔转化法 微生物细胞、动植物细胞、原生质体 微弹轰击转化法(基因枪法) 植物组织 ;10ng载体DNA;重组DNA导入的方法 脂质体介导转化法 体内注射转化法 动植物细胞、细胞器 磷酸钙转染法 动物细胞 病毒(噬菌体)颗粒转导法 构建基因文库和动物转基因;脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。;直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。;磷酸钙沉淀法;第四节 基因文库的构建;一、 基因文库的概念和文库的类别;一、 基因文库的概念和文库的类别;二、基因组文库的构建;（2）目前常用的载体 ;断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。;(三) 载体与基因组DNA大片段的连接;各种酶的接头可以向公司定做或购买。;(四) 基因组文库的大小;For example :for a probability of 0.99 with insert sizes of 20 kb these values for the E.coli (4.6×106 bp) and human (3×109 bp) genomes are : N E.coli=