《现代酶工程-11》.ppt

蛋白质定向进化技术的发展和应用——构建新蛋白质(酶)的一种途径 酶的工业应用:   利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化，已成为生产精细化学品、手性药物、食品添加剂等的重要工具,获得了广泛应用。 天然酶的局限:  随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者已经越来越发现，现有的天然酶的催化特性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求。 主要原因：1 天然酶的稳定性差、对某些底物的催 化活性低，以及缺乏有商业价值的 催化功能及其他性质2 越来越多的情况需要一些酶催化很 多在自然界中并不存在的各种底物 来完成特定的反应过程 根源:  天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。 天然酶的进化过程: 在自然进化过程中，进化保证了酶对环境任何改变的适应能力，但是自然进化既没有特定的方向，也没有特定的目标，它是在整个生物的繁殖和生存过程中自发进行. 酶的进化主要不是表现为某个酶分子的活力和稳定性的不断提高，而是在于生物整体的适应能力、调控能力的增强，因此，通常只要求酶在生物体内对特定的生物学功能有专一性。 应用过程对酶的要求  　在酶催化过程的研究和应用过程中，人们总是期望酶的活力和稳定性越高越好，并具备良好的催化性能：能在非水溶剂、极端温度和pH等特殊条件下催化反应，尤其重要的是能接受自然界中不存在的各种底物。 正是由于天然酶的性质与实际应用过程中人们对酶的期望之间的巨大差距，使对天然酶在分子水平上进行改造显得十分重要和迫切。  从目前的情况来看，具有新功能和特性的酶可以通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶进行改造，其中对于在自然进化过程中没有经过特性和功能选择的酶而言，对现有的天然酶进行改造比大量筛选可能更加合适。 对酶进行改造的理论基础:  无数的研究工作已经表明，酶分子内某些氨基酸残基的微小改变可使酶的催化能力和立体选择性产生很大的改善。 遗憾的是，由于技术的限制，酶分子中氨基酸残基与它的空间结构以及结构—功能之间相互关系等信息严重匮乏，加上这些关系又非常复杂，迄今为止，人们对它们的理解和认识仍然非常肤浅 如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景。 解决办法:蛋白质定向进化  20世纪80年代末，在PCR技术出现的初期，就有人着手利用Error-prone PCR技术改造蛋白质。 1994年，美国科学家Stemmer 开创了可以在分子水平上实现家族基金内部序列重组的新技术——DNA Shuffling，可以在一个基因及其PCR诱变产物，或一组家族基因的基础上创造新基因。 酶分子的定向进化技术 人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。 定向进化技术的作用 使发生在自然界中漫长的进化过程能在实验室中得以模拟，使人类可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至设计出自然界中原来并不存在的全新酶分子(全新蛋白质)。 与自然进化相比，酶分子的定向进化过程完全是在人为控制下进行的，使酶分子朝向人们期望的特定目标进化。 大量的研究已经表明：在目前对酶分子认识还不成熟的情况下，通过DNA水平上的适当修饰来改变酶的氨基酸顺序，进而改变酶的性能，是可能在重组生物中产生新的酶类，并获得比天然酶活力更高、稳定性和催化性能更好的进化酶，以满足研究和应用的需要。 定向进化技术( directed evolution)的原理 Susanne Brakmann and Kai Johnsson (eds) Directed Molecular Evolution of Proteins Wiley-VCH,2002, ISBN 3-527-30423-1 定向进化过程的原理 分子生物学文库的分类与构建方法 定向进化技术的发展 定点突变（site-specific mutagenesis或site-directed mutagenesis） 易错PCR技术(error prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引导重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出,