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层 析 技 术 指导教师：滕利荣 教授 第一部分 层析基本理论 一、层析技术简介 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 二、层析的分类 1、按分离相状态分类 ： 根据层析过程中的固定相和流动相进行分类，大致可以分以下几类 ： （1）气相层析是以气体为流动相的层析方法，称之为气相层析。 根据固定相的性质不同又可以分为气-固层析(GSC)和气-液层析(GLC)。前者是指载体表面含有许多吸附基团的固体吸附介质，后者是指载体表面涂有一层薄薄液体分子制成的介质。 （2）液相层析是以液体为流动相的层析方法，称之为液相层析。 同理，根据固定相的性质不同又可以把液相层析分为液-固层析(LSC)和液-液层析(LLC)。液相层析的固定相性质与气相层析相近。 （3）超临界层析是以流体为流动相的层析方式，称为超临界层析(SFC)。 它是利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离的，这种分离方法更具专一性。 2、按层析的分离机理分类 （1）排阻层析(exclusion chromatography) 利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。 （2）离子交换层析(ion exchange chromatography) 利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。 （3）吸附层析(absorption chromatography) 利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。 （4）分配层析(partition chromatography) 被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附的作用，在移动的过程中物质在两相之间进行分配。利用被分离物质在两相中分配系数的差异而进行分离的一种方法，称之为分配层析。 （5）亲和层析(affinity chromatography) 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。 （6）金属螯合层析(metal chelating chromatography) 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。 （7）疏水层析(hydrophobic chromatography) 利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。 （8）反向层析(reverse phase chromatography) 利用固定相载体上偶联的疏水性较强的配基，在一定非极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非极性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的物质的方法，称之为反相层析。 （9）聚焦层析(focusing chromatography) 利用固定相载体上偶联的载体两性电解质分子，在层析过程中所形成的pH梯度，并与流动相中不同等电点的分子发生聚焦反应进行分离的方法，称之为聚焦层析。 （10）灌注层析(perfusion chromatography) 利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与流动相中溶质分子分子量的差异进行分离的方法，称之为灌注层析。 三、柱层析法的一般技术 1．层析柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来，