薄层色谱法基础　PPT课件_精品.ppt

2.化学检出法 化学检出法是在薄层上使用一种或数种化学试剂与被检出物质反应，生成有颜色的化合物而定位。这种试剂叫显色剂。 显色剂 一般分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。 * 1 通用显色剂 (1) 浓硫酸或50%的硫酸溶液：极大多数有机物质，喷此种显色剂后立刻或在加热到110—120℃并经数分钟后出现棕色到黑色斑点。 (2) 酸碱指示剂溶液：例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液，在绿色背景上显现黄色斑，表示是脂肪族羧酸。 常用的通用显色剂还有：5%磷钼酸乙醇、 碱性高锰酸钾溶液、硝酸银-氢氧化铵试剂、荧光显色剂等。 2 专属性显色剂 指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。 例如2%2，4-二硝基苯肼乙醇溶液喷后在120℃加热10分钟，醛酮在黄橙色背景上显红色或橙色斑。 * * 3 原位化学衍生化 在色谱分析的综合技术中，尤其对痕量组分的检测，衍生化反应已成为重要手段之一。 在薄层色谱中，有些化合物本身无色，又无紫外吸收与荧光，同时也找不到合适的显色剂，或者有性质近似的化合物共存很难分离，这时可考虑在原位进行适当的化学反应，使之产生紫外吸收、荧光、显色，或使性质发生较大差异以利于分离。 * 4 生物与酶检出法(bioautography)  生物检出法又称生物自显影法是用生物检定法检出薄层上具有生物效应的物质如抗生素的方法。基于检出物质的生物活性，将薄层板与已培养有适当微生物的琼脂表面接触，并置适宜温度的培育箱内，经过一段时间后观察抑菌点，有抗生素斑点处的培养基微生物生长受到抑制，整个琼脂板出现了抑菌点，由此抑菌点可对该抗生素组分定位。 酶检出法实际上是一种酶抑制技术，用于薄层色谱检出某些有机磷农药。 * 5 放射显影法（Autoradiography） 就是用含放射性同位素的化合物在薄层上显示位置的方法。具体方法是使薄层上同位素的辐射线透过照相底片，显影以后由于银粒而显出潜影，在一定剂量范围内，放射性物质斑点使底片所呈暗度与斑点中放射性物质的浓度成正比，因此不仅可定位，还可定量。 * (七) 薄层层析的定量测定 展开后，薄层分离所得斑点中化合物可进一步定量，其测定方法可分为两大类： 一类为洗脱测定法，将所需测定的斑点中的组分用适当溶剂洗脱，再选用适当方法定量； 另一类为直接测定法，色谱分离后，直接用肉眼观察比较或用仪器扫描斑点而测定其含量。 1 洗脱测定法 1 斑点的定位 2 斑点的洗脱:用吸集器将斑点位置的吸附吸下，然后用洗脱溶剂洗脱。 3 测定 (1)紫外分光光度法：洗脱液调整至一定体积，在此化合物最大吸收波长处测定。同时把样品斑点相应位置薄层吸附剂同样取下做空白对照。 (2)比色法：选择灵敏度高、专属性好的比色反应测定化合物含量，是比较常用的方法。 (3)其它方法：极谱、库仑滴定、荧光测定等。 * 吸集器及减压洗脱装置 吸集器 减压洗脱 * * 2 直接测定法 1 目测法 样品经色谱分离后，直接观察所得斑点的大小和颜色的深浅，并与标准品在相同条件下展开所得到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较，而近似地判断样品中所测成分的含量。 2 测面积法 展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间，符合一定的线性关系。 3 仪器测定法 3 仪器测定法 用光密度计或称薄层扫描仪（TLC Scanner）扫描定量，该方法已成为薄层定量的主要方法。 1.吸收测定法 展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸光度的变化，得到扫描曲线。 利用样品扫描曲线上峰高或面积与标准品相比较，可得出样品含量。 2.荧光测定法 化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可测量其荧光强度而进行定量。 3.荧光淬灭法 由荧光减弱的程度测出斑点中化合物的含量 * 吸收测定法的分类 根据对光测定方式的不同，可分为三种： 透射法 反射法 透射—反射法 透射法扫描 反射法扫描 L 光源；MC 单色器；P 薄层板； S 斑点； PD 光电检测器 * * 仪器测定法的两个重要参数 扫描波长： (1)单波长扫描：使用一种波长的光线对薄层进行扫描。 (2)双波长扫描：是采用两种不同波长的光束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两波长吸光度之差