08.荧光原位杂技技术及其临床应用李宇中.ppt

荧光原位杂交技术及其临床应用 荧光原位杂交（FISH） 将分子带进细胞遗传学的领域 荧光原位杂交技术 90 年代以后, 随着分子生物学技术的提高以及向各学科的渗透, 出现了一种新的运用分子手段分析染色体异常的方法, 即: 染色体荧光原位杂交( FISH) 技术, 该技术不仅可用于中期分裂相, 还可在间期细胞显示杂交信号, 尤其适用于那些培养难以成功的各种组织细胞。 由细胞到DNA分子 荧光原位杂交技术的基本概念 1.脱氧核糖核酸(DNA)分子 2.脱氧核糖核酸(DNA)探针 3.脱氧核糖核酸(DNA)变性 4.脱氧核糖核酸(DNA)杂交 荧光原位杂交原理 FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸 为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未 知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的 杂交双链核酸。 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术（简称FISH）是用细胞遗传学和分子生物学的原理，通过荧光标记的核酸探针与细胞内的核酸序列杂交。借助荧光显微镜，在细胞和（或）组织中观察并分析细胞内杂交于靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息。 荧光原位杂交示意图 常见的荧色物 荧光显微镜系统 探针的标记的种类及比较 1.探针标记方法主要有两类： （1）直接标记法，就是荧光素通过一些方法直接连接到核酸序列上。 （2）间接标记法，就是把地高辛或生物素等半抗原连接到核酸序列 ，然后在杂交过后的检测阶段，加入标记有荧光素的相应半抗原抗体参与反应进行检测。 探针的标记的种类及比较 2. 这两种标记方法相比较而言各有利弊。直接法方便、快捷且背景低，信号强度不及间接法强；间接法具有信号放大系统，信号强检测灵敏度高，但是间接法杂交过后检测步骤繁琐，背景信号强。近年来荧光的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧光探针越来越成为首选, 并采用多种不同颜色的荧光, 方便在同一标本上同时检测多种异常. 其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察, 操作过程中也不需要严格避光, 鉴于直接标记法已经可以获得较满意的信号，目前临床检测用的探针多为直接标记法标记。 临床常用的探针 临床使用的探针都是以DNA 为主。 常用探针主要有： （1）着丝粒探针。 CEP:Chromosome Enumeration DNA Probes （2）位点特异型探针。 LSI :Locus specific identifier （3）染色体涂染探针。 WCP: Whole Chromosome Paints 着丝粒探针 a. 高度重复序列DNA ,重复数百次至数千次，其靶序列通常是在染色体的p11-q11区域及异染色质区域。b. 特点：信号强 c. 应用 (a)标记染色体识别。 (b)染色体数目异常检测。 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断。 着丝粒探针 位点特异型探针 a . 标记了荧光信号的DNA片段代表了某一个或几个基因位点的全部序列。主要用以染色体DNA 克隆序列的定位和靶DNA 序列拷贝数及结构变化的检测。 b. 特点：信号较小。 c. 应用: （a）定位DNA片段。 （b）确定染色体微小缺失与重复。 （c）间期细胞染色体数目异常诊断。 位点特异型探针 16号和22号染色体探针信号 染色体涂染探针 a. 涂染探针是针对某一整条染色体设计探针，涂染探针主要用于常规显带技术无法确定的染色体重排和标记染色体的确定。能对整条染色体进行荧光标记 b. 特点：结果容易判读。然而，整条染色体涂染 探针不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位。 c. 应用： （1）染色体数目和结构异常分析。 　 （2）白血病及其它肿瘤的染色体诊断 和研究。 染色体涂染探针：染色体结构异常分析 FISH技术包括下列几个步骤 1）备制玻片 2）标本变性 3）探针变性 4）杂交 5）DAPI复染 5）荧光显微镜观察FISH结果 羊水标本采集 a. 在B 超腹部探头引导下行羊膜腔穿刺，抽 取羊水20ml，其中15ml 用于常规羊水细胞培