商检标准SNT11102018新城疫病毒分离及鉴定方法.pdf

Procedure of virus isolation and identification for Newcastle disease SN ／T 1110—2002 前 言 本标准等效采用国际兽医局的标准《诊断方法和疫苗标准手册》(2000年，第四版)，并参考农业部《新城疫检疫技术规范》，结合我们的操作经 验编写、制定。 本标准的附录A、附录B均为标准的附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准起草人：单松华、胡永强。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了禽类新城疫病毒 (NDV)分离及鉴定方法。 本标准适用于禽类新城疫病毒的分离及鉴定。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修改，使用本标准的 各方应探讨使用下列标准必威体育精装版版本的可能性。 国际兽疫局《诊断方法和疫苗标准手册(2000年，第四版) 3 材料准备 所用试剂均为分析纯。 μ 3.1 普通天平、分析天平、普通离心机、V型血凝板、微型振荡器、50 L可调移液器、恒温箱、超净工作台、塑料采血管等。 3.2 抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素和制菌霉素等。 3.3 9～11日龄无特定病原体 (SPF)鸡胚、1日龄SPF鸡和6周龄SPF鸡。 3.4 pH7.O或至pH7.4 0.01 mol ／L磷酸盐缓冲液 (PBS)的配制(见附录A标准的附录)。 3.5 阿氏液(红细胞保存液)的配制(见附录B标准的附录)。 3.6 1％鸡红细胞：采集SPF鸡或无新城疫血凝抑制抗体的成年鸡血，放入等量的阿氏液中，用20倍体积的PBS洗涤3～4次，每次以2 000 r ／min离心 (3～4)min，最后一次5 min，用PBS配成1％悬液。4℃保存悬液，在72 h内使用完。 3.7 拭子准备：将脱脂棉缠于牙签的钝端，使其形成直径O.4cm的脱脂棉球，然后用牛皮纸包扎，每捆10只，121℃高压蒸汽灭菌15 min，备用。或直 接购买商品用拭子。 3.8 标准新城疫病毒、标准阳性血清：由指定单位供应。 4 样 品采集和制 备 4.1 样品采集 4.1.1 活禽采集气管拭子和泄殖腔拭子(沾有粪便)；雏禽采集新鲜粪便。 4.1.2 死禽采集口鼻拭子、肺、肾、肠 (含内容物)、脾、脑、肝、心等组织，样品可单独采集或者混合，肠内容物常需单独处理。 4.1.3 病程长的ND病鸡或非典型ND病例可采集骨髓。 4.2.1 取采集样品置于研磨器中磨碎，加入PBS制成10％～20％(W ／V)的悬液；采集的拭子浸入(2～3)mL PBS中，充分振荡，反复挤压，弃去拭子。 4.2.2 在不超过25℃的室温下，1 000 r ／m离心(10～15)min。 μ 4.2.3 上清液加入抗生素。使用何种抗生素视具体情况而定，常使用的抗生素终浓度为：青霉素(2 000IU ／mL)，链毒素 (2 mg ／mL)，庆大霉素(50 g ／mL)和制菌霉素(1 000 IU ／mg)；粪便和泄殖腔拭子样品，抗生素量提高5倍。加入抗生素后用0.2 mol ／L磷酸氢二钠 (见附录A1.1)调节pH至7.0～ 7.4。4℃作用4 h或过夜，或室温作用 (1～2)h，或37℃作用30 min，以确保无菌。 μ 或上清液经0.45 m滤膜过滤除菌。 或上清液5 000 r ／m离心10 min后，移出上清液，再8 000 r ／m离心10 min，取上清液进行下一项试验。 4.2.4 上述除菌液应尽快进行试验。如没有条件，可在-30℃冷冻保存。 5 操作方法 5.1 病毒分离培养 5.1.1 细菌污染检查 将上述除菌液