遗传学经典课件第12章 基因表达调控.ppt

本底组成型合成 阻遏蛋白与lacO的结合有一个10~20分钟的半衰期： RNA聚合酶抓住阻遏蛋白脱离lacO的极短时间，转录产生1-2个mRNA, 翻译生成三种酶. * 小结 有葡萄糖存在时， * 实验验证 Pardee、Jacob、Monod设计了历史性的实验来检验他们的模型的预测是否正确。 1. 实验原理 * 2. 实验过程 通过F因子，给lacI-或lacOc的突变菌输入野生型lacI或lacO基因，观察其对?-半乳糖苷酶活性的影响。 实验1： 组成型突变 lacI- lacZ+ F菌株 F’ lacI+ lacZ- 乳糖诱导型菌 说明F菌株的lacI+能弥补原菌株的lacI-缺陷。 即：lacI 对lacZ是反式作用（trans-acting）。 * * 组成型突变 lacI+ lacOc lacZ+ F菌株 F’ lacI+lacO+ lacZ- 组成型表达 实验2： 说明F菌株的lacO+不能弥补原菌株的lacOc缺陷。 即：lacO对lacZ是顺式作用（cis-acting）。 * * 实验3 lacI超突变（lacIs）编码的阻遏物不能与乳糖结合，所以总是结合在O区的DNA上，使lacZ不能表达。 * 野生型 lacI+ lacZ+ F菌株超突变 F’ lacIs lacZ+ 组成型不表达 说明超突变lacIs 编码的阻遏物能作用于野生型菌操纵子的O区。 利用超突变： * * * 操纵子模型的意义 Jacob和Monod1961年发表的操纵子理论是遗 传学的的一个里程碑（landmark）。 用遗传分析结果推论出分子生物学模型并验证。 暗示了蛋白质与DNA结合的概念。 描述了“阻遏物”的调节因子概念（尽管当时并不知道它是蛋白质还是RNA）。 当时人们刚知道mRNA，对转录的细节一无所知！ * 附：阻遏物的分离和鉴定 阻遏物的含量极少，每细胞不超过10份。 直到1966年，Walter Gilbert和Benno Muller-Hill从lacI的超量突变菌株中，利用透析（dialysis）的方法，通过IPTG与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋白质。 Gilbert及其同事又用放射自显影证明它能与lacO DNA结合。 ① 分离 ②鉴定 * 放射性标记的阻遏物能与野生型O区结合 * 放射性标记的阻遏物不能与突变型O区结合 * ③Lac 阻遏物的空间结构 两个binding domian: 四聚体聚合区 C N 一个四聚体聚合区 * ④阻遏物与DNA的结合 i）电镜观察 Lac repressor * ii）X-ray分析 两个单体结合在一个完整的lacO区； * 四聚体可以结合两个lacO。 * iii）DNA测序分析 阻遏物所结合的DNA有26bp（-5 — +21）。位于RNA多聚酶结合部位的下游内部。 GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTT …ATG mRNA protein RNA pol binding site repressor binding site 对称轴 * 乳糖操纵子的正调控（positive control） Jacob-Monod 模型没能回答一个关键性的问题： 为什么E.coli 在既含有葡萄糖（glucose）又含有乳糖的（lactose）的培养基（medium）中不启动lac 操纵子的转录？ Answers to this question emerged from molecular studies carried out long after publication of the operon theory. * （1）正调控因子（positive regulator） 在有些启动子上，RNA pol结合后并不能启动转录。必须一个激活因子（正调节因子）的帮助才能打开DNA双链。 CAP是lac operon的正调节因子。 （2）CAP的作用原理 ① cAMP+CAP → cAMP-CAP复合体 * ② cAMP-CAP与lac操纵子启动基因上的一个位置结合后 ，RNA聚合酶才能与启动子结合。 ③ cAMP是由ATP经过腺苷酸环化酶（Adenyl cyclase）的作用形成。 ATP cAMP Adenyl cyclase * 葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性，从而 间接地抑制了Lac操纵子的转录。 CAP-cAMP系统在半乳糖和阿拉伯糖 操纵子中也起作用。 葡萄糖浓度 ↑ cAMP↓ 葡萄糖浓度 ↓ cAMP↑ * * （3）CAP与DNA的结合 lac操纵子中，CAP结合位点位于RNA pol结合位点的上游（-22bp