《基因结构与表达分析的基本策略》.ppt

基因结构与表达分析的基本策略 一、DNA序列分析 （一）双脱氧末端终止法 (Sanger ,1977) （二） DNA自动化序列分析 （三）化学降解法 (Maxam ＆Gilbert ,1977 ) DNA合成模式图 以DNA合成反应为基础。 （二）DNA测序自动化原理 1. DNA自动测序步骤： 4种不同带有荧光染料标记的终止物ddNTPs 荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序。 二、核酸分子杂交 （Nucleic Acid Hybridization ） ● Southern印迹杂交: 检测DNA （Southern EM ，1975） ● Northern印迹杂交: 检测RNA （Stark GR，1977） 核酸分子杂交原理 （一）Southern印迹杂交 (Southern blot hybridization) 将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。 （二）Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization) 指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 可以对mRNA进行定性和定量分析。 （三）其他杂交技术 1. 斑点杂交 (dot blot hybridization） 2.原位杂交（in situ hybridization） 三、Western免疫印迹 Western blot原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。 引物的化学本质是什么？ 单链寡核苷酸DNA或RNA片段。 1. PCR循环由三步组成： PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA 聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。 其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。 3. PCR扩增终产物大小: 介于两条退火引物5′末端之间的双链DNA片段。 4.什么叫引物延伸产物？ 比两引物限定区长的延伸产物。仅发生在以原始模板DNA为模板的扩增过程中，以倍数形式扩增(2n)。 （二）平台期与平台效应 1. 平台效应（plateau effect）： PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入静止期即平台期。 PCR平台效应 二）耐热DNA聚合酶 （三）高保真的耐热DNA聚合酶 （一） PCR耐热DNA聚合酶的发现 （二）Taq DNA聚合酶 从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。 1.较高的热稳定性 ● 95℃的半衰期: 40 min ● 最适温度: 72 ℃ ～80 ℃ ● 催化反应速率: 150～300核苷酸 / 秒/ 酶分子 Taq DNA聚合酶特性： ● 5′→3′聚合酶活性； ● 5′→3′外切酶活性； ● 逆转录酶活性； ● 较弱的非模板依赖性； ● 缺乏3′→5′外切酶活性。 2. 无机离子及抑制剂 Taq DNA聚合酶的活性对Mg 2+ 浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。 3. 保真性 如何提高PCR DNA聚合酶的保真性？ ① 使用Taq DNA聚合酶时，掺入少量具有3′→5′外切酶活性的耐热DNA聚合酶,错配率可降为原来的1/10； ② 使四种dNTP底物浓度相等； ③ MgCl2浓度尽可能低； ④ 减少循环数。 （三）几种高保真的耐热DNA聚合酶 1. Tth DNA聚合酶 2. Vent DNA聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶 引物序列及其与模板特异性结合是决定PCR反应结果的关键。 1.引物设计原则: ① 引物长度: 10～30 nt 简并引物设计及应用： ① 对纯化的未知蛋白测定一段短 氨基酸序列。 ②不同物种某一基因编码的保守 氨基酸区域。 4.优化的引物设计实例 上游引物序列： 5′AGAACATGGTGCGCAGGTT3′ 下游引物序列： 5′TGCCCATCATCATGACCTG 3′ 5′ CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGG