《第3章细胞工程》.pptVIP

Chapter 3 Cell Engineering第3章 细胞工程 目的要求 【掌握】动物细胞工程、植物细胞工程、微生物细胞工程的基本原理；动植物细胞及组织的培养方法；单克隆抗体的制备原理和步骤。 【熟悉】干细胞的概念与用途；利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本过程及其重要意义；单倍体植物的诱发及人工种子制备的基本要领；植物脱除病毒的途径和检测手段。 【了解】制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法；细胞工程与现代生物技术的关系；细胞工程的发展与相关学科的联系 。 3.1 细胞工程的基础知识与基本技术 3.1.2.2 细胞培养技术 取样 灭菌 培养 传代 收获 除菌 取样 细胞培养是指动物、植物或微生物的细胞在体外无菌条件下的存活和生长技术，此时细胞不再分化成组织。 组织培养是指从机体内取出组织或器官，在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温、湿）的条件下或模拟机体内生理条件下，在体外进行培养，使之生存或生长，甚至发育出个体的技术。 习惯上，动物学和医学上往往用组织培养(tissue culture )这一术语泛指细胞、组织和器官在适当的培养条件下离体生长的技术。 3.2 植物细胞工程 MS培养基 细胞分裂素类激素 愈伤组织是离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织（松散的细胞团 ）。 3.2.1.3 继代增殖阶段 3.2.2 植物细胞培养和次生代谢物生产 紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中， 其中树皮中的含量最高，大约从12000株成年紫杉树中才能提取1Kg的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。 紫杉醇的国际市场价格为450美元/g 日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，筛选得到细胞培养4周就增殖了5倍，紫杉醇的含量达到了0.05％，比树皮中紫杉醇的含量高达10倍。 Ketchum从6种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的诱导，获得了产生紫杉醇的高产细胞株，在悬浮培养下，细胞内的紫杉醇含量超过了20mg/L。 清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4周内获得20g/L干物质，利用代谢调控技术在2~3天内将紫杉醇的含量提高到0.063%左右。 3.2.3 植物原生质体制备与融合 原生质体的分离 聚乙二醇（PEG）的作用 1、PEG可能使细胞膜的脂类分子的物理结构发生重排，容易被PEG作用打开细胞膜（尤其在高钙、 高pH 条件下），使细胞融合。 2、PEG可能会把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂质体扦入与膜结合。 3、PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而膜融合。 PEG诱导细胞融合的效果： 同其分子量大小及浓度高低相关。常用分子量为1000－6000，浓度为30－50％ PEG使细胞融合或致死的剂量界限很狭。 须严格掌握PEG的处理时间。 悬浮法，处理1－2分钟为宜。 离心法，先将细胞混合物悬于30－40％的PEG中，再通过离心进行融合，可适当延长接触时间，以5－8分钟为宜。随后，均须立即加液稀释，以及时终止PEG作用。 野生马铃薯和栽培马铃薯细胞融合 “番茄-马铃薯” 植物脱毒技术的意义 物理方法：温度（高温） 化学方法：孔雀绿等（难） 生物学方法：芽尖、根尖 综合脱毒方法 生物学方法 茎尖培养 茎尖越小越没病毒，但越小越难成活,一般要超过2万个细胞，或至少3~10 mg茎尖。 花瓣培养 花药培养 生物学脱毒方法的基本流程 植物脱病毒进展 3.3 动物细胞工程 细胞株（cell strain)  指通过选择或克隆从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的培养物或细胞。通常把原代细胞和50代前的传代细胞叫做细胞株。 细胞系（cell line)  原代培养物经首次传代成功后的细胞培养物，包括有限细胞系和连续细胞系。细胞系着重于指传50代后，遗传物质发生了改变，并且有癌变的特点，无限传下去的传代细胞。 3.3.1.4 无血清培养 培养液（液体培养基）：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。 细胞和组织的体外培养一般都需添加一定量的血清，不仅价格昂贵、容易混进污染物(包括病毒和病菌)，而且其成分不能完全确定，不同批次的血清之间难以保证实验结果的可重复性。因此无血清培养日益受到重视，并已取得了较大的进展。 3.3.1.5 培养物的长期保存 目前