《基因诊断-医本》.ppt

第十二章基因诊断Gene Diagnosis 第一节 基因诊断的技术和方法（以遗传病诊断为例） 一、基因诊断的概念与特点 二、基因诊断的常用技术及应用举例 1. Southern blot 的基本步骤： 提取DNA→ 限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。 Northern印迹(Northern blot)杂交 用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。 Northern blot 的步骤：RNA经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反应检测特定的mRNA分子的含量与大小。 斑点杂交(dot blot hybridization) 镰状红细胞贫血病基因诊断举例： 正常的（N）的： 5′-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3′ 突变的（M）的： 5′-ACT CCT GTG GAG AAG TCT GC-3′ 镰状红细胞贫血患者基因组的ASO杂交法检测 正常的（N）的ASO探针： 5′-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3′ 突变的（M）的ASO探针： 5′-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3′ Allele Specific Oligonucleotide （ASO） 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。 斑点杂交 一对引物：正向和反向 限制了PCR扩增的片段的范围 2. PCR在基因诊断中的应用 荧光定量PCR 多重-PCR PCR-ASO AS-PCR PCR-SSCP PCR-RFLP PCR-ASO AS-PCR（allele specific PCR）等位基因特异PCR：根据引物3′端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物 （三）单链构象多态性分析（ Single-strand conformation polymorphism，SSCP） DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同—单链构象多态性（Single strand conformation polymorphism，SSCP），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链得以分离。 （四） 限制性片段长度多态性分析Restriction Fragment LengthPolymorphism（RFLP） PCR-RFLP 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR 产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。 （五） DNA序列测定（DNA sequencing） 根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。 直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常 间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析 （一）直接诊断途径 1. 必要条件： 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知 （二）、间接诊断途径 1、采用原因： 致病基因未知或基因结构不确定 致病突变机理不清 致病位点不便检测 RFLP 标记的连锁分析 基因诊断的其它应用举例 病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，如图2所示，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A 例：序列分析用于基因诊断研究 表12-2 基因诊断中常用的分子生物学方法比较 选择合适的片段 突变引起核酸构象改变 而有不同电泳结果 SSCP 选择引物 变异引起扩增产物不同 PCR 选择合适的探针 错配时杂交信号减弱或消失 核酸分子杂交 关 键 问 题 基 本 原 理 方 法 关 键 问 题 基 本 原 理 方 法 全序列比较差异 DNA测序 选择合适的限制性内切酶 基因变异改变酶切图谱 RFLP 三、 基因诊断技术路线与方法 RFLP 2. 点突变的检测： （1）导致特异性限制性内切酶位点改变 （2）无限制性酶切位点改变 斑点杂交、反向斑点杂交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR产物直接测序 举例：β-地贫的PCR-RE（直接诊断） PCR-RE分析 MaeI CAAG CTAG 1： 未酶解片