基因治疗原理与研究进展医本.ppt

第十三章基因治疗原理与研究进展 根据靶细胞不同，基因治疗分为： 体细胞(somatic cell)基因治疗 生殖细胞(germline)基因治疗 只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代 基因治疗的概念 将某个遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的方法。  第一节 基因治疗的策略 基因治疗的两种方式 基因治疗的方式 直接体内疗法（in vivo） 是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。 2. 间接体内疗法（ex vivo） 是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。 2.逆转录病毒介导的基因转移系统 2.逆转录病毒介导的基因转移系统 Retroviral packaging system 3.逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。 包装好的假病毒颗粒易于分离制备。 逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。 AAV的特点 ● 以潜伏感染为主； ● AAV可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。 第三节 基因干预 二、RNA干扰 （RNA interference，RNAi） 由双链RNA介导的细胞内特异性mRNA降解过程，导致靶基因的表达沉默。 四环素抗性操纵子系统原理 四环素抗性基因的转录受Tet阻遏蛋白的负调控。 无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达。 四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。。 第一例基因治疗 －腺苷脱氨酶缺乏症 生理：腺苷脱氨酶是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。 病理：腺苷脱氨酶缺乏－脱氧腺苷不能脱氨－脱氧腺细胞内堆积－淋巴细胞死亡－机体免疫功能缺乏。 治疗基础 腺苷脱氨酶基因位于20号染色体长臂 1983年腺苷脱氨酶基因被克隆 应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞 新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达 治疗步骤 抽取病人骨髓，分离淋巴细胞 将病人淋巴细胞与携带腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒载体混合培养，使腺苷脱氨酶进入淋巴细胞 清洗淋巴细胞，去除多余病毒载体。应用抗性基因等方法选择阳性细胞，检测细胞内外腺苷脱氨酶含量 治疗步骤 确定腺苷脱氨酶在淋巴细胞有满意表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回患者体内 密切观察病人各项免疫指标的变化，必要时加以调整和重复 经如上治疗后，患病女童免疫功能基本恢复。以后又连续进行了多次输入 逆转录病毒载体 +FⅨcDNA 重组体 5’ LTR FⅨ neo SV PSO LTR 3’ ①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达； ②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→FⅨ表达； ③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。 是我国基因治疗成功的例子。 第六节 基因治疗的问题与展望 安全性问题 1999年首例基因治疗失败事件 只限于体细胞，提倡间接体内法、主要用于单基因遗传病治疗、疗效显著并经过动物实验验证等。 社会伦理问题 禁止用于生殖细胞 防止不当应用（如体育上） 技术问题 目的基因及调控元件选择 安全高效载体构建及转移技术 靶细胞选择 BALB/c裸鼠乳腺癌移植瘤动物模型的建立 BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验 BALB/c裸鼠移植瘤治疗结束后的肿瘤体积 RT-PCR 检测肿瘤组织 HSVtk 的表达水平 目的要求： 掌握：基因治疗的基本策略及常用载体。 熟悉：基因转移的基本技术；基因干预的常用方法；治疗基因的受控表达原理与方法 。 Tet-Off 系统中，Tet控制的转录活化子（tTA）是野生型Tet阻遏蛋白（TetR）与一活化蛋白（AD）的融合体。 Tet-On 系统中，TetR中四个氨基酸变化使其结合特性变为方向（rTetR)。 第五节 基因治疗的应用研究 1．腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症 2．珠蛋白生成障碍性贫血和