仪器分析研讨——陈锋.pptx

现代生化仪器分析;电泳的基本原理;电泳的分类; 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE);不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳;分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度;在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。;电泳装置;;研究背景：;AbstractIntroduction：;质粒的构建;蛋白表达和纯化;检验重组蛋白准确表达;重组TSWV N蛋白可以与E.coli 的胞内RNA结合;TSWV N 蛋白可以形成不同形式的低聚物;由于做电泳使用的蛋白是用Ni-NTA纯化得到的蛋白，所以这些蛋白中带有组氨酸标签。为了排除低聚物的形成是由于这些标签引起的这一可能。我们把带有标签的蛋白的N末端的组氨酸标签切去得到不带有标签的蛋白。对这些蛋白进行相同的电泳分析，得到如下图的结果。;为了更进一步的证实以上的结论，我们在纯化的蛋白中加入了交联剂（戊二醛）。然后在5%-20%SDS分离，并用考马斯亮蓝染色。从电泳图中很明显的可以发现，随着交联剂的不断增加，各个类型低聚物的条带的颜色不断加深。这就又证实了以上的结论：TSWV N蛋白可以形成一系列的高度有序的低聚物。;TSWV N 蛋白的低聚物与RNA的结合;接下来为了确定N 蛋白结合RNA是否是形成蛋白低聚物所必须的，我们将经过PEI处理的蛋白和未经PEI处理的蛋白分别进行BN。得到了如下图所示的电泳图谱：;分析N蛋白与RNA的结合作用。将一定量的PEI处理过的N蛋白与未标记的RNA（ssRNA，带有TSWV末端序列）混合，并逐渐增加RNA的量，然后将混合物在不连续的非变性凝胶中电泳。同样的样品也进行了变性的SDS。;TSWV N蛋白可以结合E.Coli的内源RNA，我们利用它这一特点来论证N蛋白形成的各个类型的低聚物都可以与RNA结合。;从琼脂糖电泳图谱中可以看出，在1,2,3,4区域内均检测到了RNA，所以可以得出结论，TSWV N蛋白所形成的不同形式的低聚物均可与RNA结合。;构建TSWV N 和N-RNA复合物的同源模型;上图便是通过I-TASSER程序模拟出来的TSWV-N的结构，从图A中可以看出这个结构由四部分组成，分别是N-末端臂，C-末端臂，N端结构域，C端结构域。图B是图A旋转90度的效果图。N端??C端的臂可能与蛋白低聚物的形成有关。N端和C端结构域形成了N蛋白的核心结构。N端和C端形成了一个裂缝可能与RNA的结合有关;为了进一步验证模拟的结构的准确性，我们将与TSWV 病毒同科的其他布尼亚病毒的N结构进行比对，将二者重叠，可以发现两者的结构出C和N端的臂不同外，主要的核心结构域非常相似而且重叠起来。这就证明了模拟结构的准确性。;模拟一条有11个核苷酸的RNA链与N蛋白结合，得到E图的N-RNA复合物的结构。和明显看出，RNA链牢牢的嵌入核心结构域形成的裂缝里，被两侧的蛋白包裹。对非结构的表面电荷进行分析，得到F图，在RNA与蛋白的结合的裂缝的区域存在大量的正电荷（蓝色区域）。;确定TSWV N蛋白上的RNA结合位点;把这些保守的，带正电的以及极性的氨基酸作为突变位点进行定点突变。将这些氨基酸突变成丙氨酸。选取十个突变位点进行丙氨酸替换。 R60A, K65A/K68A, K81A, R94A/R95A, K183A/Y184A, and K192A/T195A。在E.Coli 中表达出所有的突变体蛋白，用PEI除去E.Coli的内源RNA，然后用Ni-NAT纯化。纯化出的蛋白在蓝色的4%-16%非变性胶中电泳，各种类型的低聚物得到分离。如下图所示：;为了确定各种突变的蛋白是否都对与RNA的结合能力产生了影响，我们分别测定了突变蛋白RNA复合物的解离常数。首先从凝胶中回收各种突变蛋白，将蛋白与一定量的RNA探针混合（DIG标记且包含TSWV末端序列），使二者结合形成复合物，采用滤膜结合法（Filter Binding assay)测定解离常数。结果如下图所示：;为了进一步证实以上的结论，我们对以上的两种突变体进行凝胶迁移分析（Electrophoretic mobility shift assay EMSA）。DIG标记的RNA探针分别与野生型，R95A/R94A突变型，和K183A/Y184A突变型杂交，并且不断增加蛋白的含量。然后分别在1%的琼脂糖凝胶中电泳，然后检测DIG探针。得到下图结果： ;因此Arg94, Arg95, Lys183, 和 Tyr184这些氨基酸残基对蛋白与RNA的结合起着至关重要作用，在模拟结构中显示氨基酸位置发现这些氨基酸刚好位于蛋白表面的裂缝区域。;RNA结合TSWV N蛋白形成复合物后对RNA酶的抵抗作用分析