如何进行染色.doc

I. 细胞的染色例 ? 1. 染色例1 以染色HeLa细胞为例，介绍使用如下试剂的方法 1）. 试剂溶液的配制 配制以下的储备液 Calcein-AM????????????? ?0.5 mg/ml DMSO solution BCECF-AM????????????? 1 mmol/l DMSO solution CFSE????????????????????????? 1 mg/ml DMSO solution CytoRed???????????????????? 1 mmol/l DMSO solution FDA?????????????????????????? 0.5 mg/ml DMSO solution PI??????????????????????????????? 1 mg/ml H2O solution EB????????????????????????????? ?1 mg/ml H2O solution DAPI????????????????????? ????1 mg/ml H2O solution AO???????????????????????????? 1 mg/ml H2O solution (* DMSO solution在-20℃的条件下保存,避免失效) ? 2）. 器具 盖玻片 18 mm × 18 mm 培养皿 (直径约35 mm) 镊子 ? 3）. 操作 1) 用5.0 ml PBS(-)溶解10 μl储备液，配制成染色液。 *由于用DMSO溶解的储备液在水溶液中易分解，所以染色液要现配现用，放置长时间后不能染色。 2) HeLa细胞用Trypsin-EDTA制成细胞悬液。 3) 将细胞悬液离心分离(速度: 1,000 rpm，时间: 3分钟)。 4) 去除上清液，加入PBS(-)，控制细胞数量在10e5-1e06个/ml。 5) 用移液枪吹打充分。 6) 在1.5 ml微管中加入30 μl第4) 步得到的细胞悬液。 7) 加入15 μl染色液。 8) 盖上盖子，在37℃的条件下，孵育15-30分钟。 9) 取10 μl第8) 步的染色溶液滴加在盖玻片上， 上面再覆盖另一张盖玻片。 10) 将盖玻片放在荧光显微镜下，用染色试剂对应的激发波长观察。 ? ? 2. 染色例2 以MitoRed染色细胞为例，介绍使用如下试剂的方法 1）.试剂溶液的配制 配制以下的储备液 MitoRed 1 mmol/l DMSO solution (用78 μl DMSO溶解1支50 μg的MitoRed) (*DMSO solution在-20℃的条件下保存，避免失效) 2）. 操作 1) 用培养基稀释1 mmol/l 储备液。MitoRed终浓度为：20-200 nmol/l *加入到细胞前，推荐先在37℃保温 2) 在细胞培养板上培养细胞 (细胞浓度：1×105- 1×106个/ml)。 3) 去除培养基，用 (培养基：PBS，Hank’s溶液等)轻轻地清洗。 4) 将稀释的试剂溶液添加至每孔，在培养条件下，培养30-60分钟。 5) 去除含色素溶液的培养基，添加新的培养基。 6) 用荧光显微镜观察。固定细胞的时候，在第4) 步的操作后按以下步骤操作。 5) 去除MitoRed溶液，用不含血清的培养基， PBS，Hank’s溶液清洗。 6) 用10%中******尔马林缓冲液，固定15-20分钟。 7) 用PBS清洗。 8) 用荧光显微镜观察。 图P-7-1 j) 染色HeLa细胞的荧光图像。 ? ? 3. 染色例3 介绍以Hochest 33258,33342染色细胞为例 1）. 试剂溶液的配制 配制以下的储备液 Hochest 33258 1 mg/ml H2O solution Hochest 33342 1 mg/ml H2O solution 细胞固定液：1%戊二醛/PBS(-) 培养液：PBS(-) ? 2）. 操作 1) 将含约1×106个细胞的细胞培养基离心5分钟(速度：400 x g )，去除上清液。 2) 加入100 μl细胞固定液，采用吹打等方法，充分混合。 3) 在室温下静置30分钟。 4) 离心5分钟 (速度：400 x g)，去除上清液。加入1 ml PBS(-)混合后，再离心5分钟 (速度：400 x g )。 *此操作为了充分清洗掉戊二醛，如果存在戊二醛，会导致淬灭。 5) 加入20 μl PBS (-)，混合后加入4 μl荧光色素，再混合。 6) 滴1滴细胞染色液在载玻片上，将盖玻片盖在上面。 7) 用荧光显微镜观察。 图P-7-1 k)、I)染色正常人胎儿细胞的荧光图像。 ? ?