05第五讲 其它工具酶教程教案.ppt

其它工具酶2014-9-29;一、逆转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶，其产物DNA 称cDNA，即互补DNA。 逆转录酶也是一个多功能酶 ;1、RNA依赖的DNA聚合酶 以RNA链为模板，以带有3’-OH末端的DNA片段为引物，沿5’? 3’方向合成DNA链。 几乎所有真核生物的mRNA分子3’末端都有一段Poly A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成cDNA。 ;2、外切RNA酶活性 底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水解方向有两种： 从RNA链5’末端外切：称5’? 3’外切RNA酶 从RNA链3’末端外切：称3’? 5’外切RNA酶 ;3、DNA依赖的DNA聚合酶 以ssDNA为模板，以带有3’-OH末端的DNA片段为引物，沿5’? 3’方向合成DNA链。 可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA。 ;4、逆转录酶在基因工程中的应用;5、商品化的逆转录酶 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶 Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆转录酶 两种逆转录酶均无3’? 5’外切DNA酶活性，故不具备校对功能，在高浓度dNTP和Mn2+存在下，容易出现核苷酸错误掺入。;二、甲基化酶（Methylase） ;2. E.coli 的dam、dcm甲基化酶;该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。;E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的限制系统 mcrA、 mcrBC 和 mrr 它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列 都降解由 CpG 甲基化酶（M SssⅠ）作用的 DNA 。 ;(一）甲基化酶的种类与识别序列 (二）甲基化对限制酶切的影响;1、修饰酶切位点;2、产生新的酶切位点;三、核酸酶SI;2. 作用条件： 需要Zn2+作为辅助因子，最适pH是4.5这是与基因工程的其它工具酶不同的两个特点。 3. 在基因工程中的应用： 由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。 切除单链粘性末端，产生平末端，再用T4连接酶连接。 切除cDNA的发夹结构。;1. 作用特点： 此酶是从小牛腺中提取的，可催化单核苷酸转移到另一个DNA分子的3’-OH末端上，不需要模板，其引物是带3’-OH末端的ssDNA（Mg2+为辅因子）。 平末端的dsDNA或带有3’延伸末端的dsDNA，只有CO2+存在时才能作引物。;2. 在基因工程中???应用： 在连接平末端DNA片段时加上互补的同源多聚物（同聚物加尾法）;五、外核酸酶III;作用特点 此酶是从乳白短杆菌（Brevibacerium aldidum）中提取的。 能以渐进的方式从线型DNA分子的3’，5’两端同时降解，产物是单核苷酸或寡核苷酸片段：形成截短了的平端双链 DNA 分子（约占 10-20%）以及带有约 5 个核苷酸突出单链的截短分子（约占 80-90%）。 作用对象：可以是带粘末端或是平末端的dsDNA，对3’，5’两端的结晶速度相同。 ;2. 作用条件： 降解时需要Ca2+作辅助因子，以EDTA作螯合剂，可使Bal 31失活 3. 在基因工程中的应用： 可用于组建DNA的物理图谱，以及造成克隆DNA分子的末端缺失;1. 作用特点： 此酶是从噬菌体T4感染的E.coli中分离的 能催化ATP的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’-OH末端上;2. 在基因工程中的应用： 可用于缺乏5’-磷酸的待连接DNA片段的5’端磷酸化：反转录mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR扩增得到的DNA都缺少5’-磷酸基，在与克隆载体连接之前，需用T4多核苷酸激酶将DNA的5’-磷酸化。; 1. 作用特点： 从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP 从小牛肠中分离的简称CAP。 它能特异性地切去DNA或RNA的5’-磷酸。 底物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也可以是核糖或脱氧核糖核苷三磷酸。 ; 2. 在基因工程中的应用： 在用32P标记DNA的5’末端之前，除去未标记的磷酸。 在DNA重组技术中，除去DNA片段的5’-磷酸，阻止质粒自身环化，提高转化效率。 ;形成带有两个缺口的开环分子，由于环状DNA（即使是有缺口的环状DNA）的转化效率比线状质粒DNA片段高得多，因此绝大多数转化子都含有重组质粒，并且这样的缺口在寄主细胞内可自行补上。 ;九、依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶 ;RNA 聚合酶实际上就是转录中的 RNA 合成酶，识别 DNA 中各自特异的启动子序列，并沿此 dsDNA 模板起始 RNA 的合成。无需引物，但需识别特异性位点。;