12 分子生物学研究分析方法xg.ppt

DNA重组过程： 重组DNA 质粒DNA 基因片段 1972年,P.Berg: 构建第一个DNA重组分子 1997年,动物克隆: 克隆羊多莉诞生 1977年，基因工程产品的出现 H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS) 1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验 2001年，人类基因组计划 人体生长激素释放激素(SS) 抑制和调节多种激素的作用 从动物脑中提取: 5mg50万只羊脑 基因工程 9升大肠杆菌 培养液 基因重组技术应用 大肠杆菌 SS蛋白 重组体 + SS基因 目的基因 基因载体 外源基因在宿主细胞中的表达 重组子 目的基因的mRNA 表达蛋白质 大肠杆菌（ E.coli）受体细胞 表 1 E.coli表达体系 优势： 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达 不足之处： 1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。 2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。 3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。 2目的基因在E.coli中的高效表达 三个因素： 强化蛋白质的生物合成 抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象 3目的基因表达产物的检测 1）蛋白质的PAGE 对照 样品 Marker 2）表达蛋白生物学功能检测 淀粉酶基因表达 4目的蛋白的分离纯化 分子筛 亲和柱 离子交换 抗原抗体 目的蛋白 基因组DNA文库 限制性内切酶 基因组DNA 基因与载体重组 转化细菌 体外包装 染色体步移克隆基因 C 重组DNA实验中常见的主要工具酶 酶?????? 类 功????? 能 限制性核酸内切酶 识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子 DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5到3方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口 反转录酶 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链 多核苷酸激酶 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端　　（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接） 末端转移酶 在双链核酸的3‘末端加上多个单核苷酸 DNA外切酶III 从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸 λ噬菌体DNA外切酶 从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶 切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团 限制性内切酶酶切 切 酶切 限制性内切核酸酶 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 命名：酶来源的生物名称缩写 属名-种名-株名-发现次序 例如：HindIII 表示 流感嗜血菌(Heamophilus influenzae) 的Rd菌株中发现的第三个酶 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ EcoRⅠ的识别序列 HaeⅠ的识别序列 5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端） pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’ 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘ 5’NNNNNGTT pAACNNNNN3’ 3‘NNNNNCAAp TTGNNNNN5’ HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端） 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 接 T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h； 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC Ha