15.第十五章 基因工程与分子生物学常用技术知识.ppt

第十五章 基因工程与 分子生物学常用技术;第一节 基因工程与基因重组;(一)工具酶; 不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种不同的情况：;2.DNA聚合酶;4.逆转录酶;(二)载体;①质粒是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制的、并与细菌或细胞共存的遗传成分，可赋予宿主细胞某些遗传性状。 ②通常质粒的大小为2～300kb。 ③一般只能容纳10kb的外源DNA片断。;(3)粘粒(cosmid);二、重组DNA技术的基本原理和过程;(一)目的基因的制备;3.聚合酶链式反应(PCR);(二)目的基因与载体的连接;(三)将外源DNA导入宿主细胞;1.遗传学方法 针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基因(ampr、tetr 、kanr等)和目的基因而设计的筛选方法。 2.分子杂交方法 利用32P标记的探针与重组DNA或克隆DNA片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。 3.免疫学方法 利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛选。;(五)克隆基因的表达;2. 特点 针对性强、特异性强、灵敏度高、适应性强。;1. 基因治疗是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因表达的一种治疗疾病的方法。 2. 狭义的基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，与宿主细胞的基因整合后表达以达到治疗疾病的方法。 3. 广义的基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用以达到治疗疾病的方法。 ;5.基因治疗的基本程序;(The Technology and Application in Molecular Biology);(一)探针(probe);(二)核酸分子杂交的基本方法;;3.斑点及狭缝印迹杂交 (1) 指将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，称为狭缝印迹杂交。 (2) 主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。;二、聚合酶链反应;n个循环;PCR反应体系： 1. 引物 是PCR特异性反应的关键，取决于引物与模板DNA互补的程度。 2. 酶浓度　酶催化的PCR反应的Taq DNA聚合酶量约需2.5U。 3. dNTP的质量　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当，易变性失去生物学活性。 4. 模板核酸　模板核??的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一。;1．可分析基因转录产物；构建cDNA文库；克隆特异cDNA；合成cDNA探针。 2．可判断突变的基因片段，如癌基因和抑癌基因中点突变的检测和鉴定。 3．用于病原微生物的微量检测及鉴别菌株；突变基因的筛选；法医学鉴定；DNA序列分析；器官移植配型等。 4．应用于遗传性疾病的诊断如地中海贫血、苯丙酮酸尿症等；感染性疾病如肝炎、结核等诊断。 5．根据已知致癌基因顺序设计特异的模板和引物，用于筛选特异的抗肿瘤化合物。;三、核酸的序列分析;采用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子发出不同波长荧光，采集荧光信号，确定DNA碱基的排列顺序。 ;四、基因文库;是将蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，可特异性与待测样品中的靶蛋白反应，再进行定性或定量分析的技术。;六、生物大分子相互作用研究技术