19第十九章节 基因组、蛋白质组和功能蛋白研究进展.ppt

;（一）蛋白质工程研究的一般规律及其技术路线 1. 对蛋白的改造有一定的规律可循。 ①疏水性氨基酸常常出现在蛋白质的活性中心区域；α螺旋和β折叠区通常不会出现在酶的活性中心（即配体、底物的结合区），而是作为空间结构的支架；  ②在进行点突变时要注意那些保守的氨基酸残基，如果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的蛋白质性质时，则应尽量保留保守的氨基酸残基； ③应注意保留潜在的N糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr-X-Pro）中的Asn、Ser或Thr，因为在很多情况下，特别是分泌性蛋白和跨膜蛋白，能否正确糖基化对蛋白活性的影响很大； ④对于断裂基因序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠；; ⑤构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位落在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘； ⑥如果对目的蛋白的三维结构一无所知，可以进行试探性观察，则在目的DNA序列中随机插入六聚体寡核苷酸接头以鉴定功能性结构域是否改变。 ⑦进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。如果直接利用这种限制性内切酶位点，很容易破坏正确的开放阅读框架（ORF），或使得最后得到的缺失突变体边界不能落在适当的位置，而影响蛋白质的正确折叠。; 蛋白质工程主要集中在改造现有的蛋白质这一领域。步骤： ①要分离纯化需改造的目的蛋白； ②对已分离纯化的目的蛋白进行氨基酸序列测定、X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等一系列测试，尽可能多地获得该蛋白结构和功能的数据； ③通过蛋白序列设计寡核苷酸引物或探针，从cDNA文库或基因文库中筛选和获得编码该蛋白的基因序列； ④设计改造方案； ⑤对基因序列进行改造； ⑥将经过改造的基因片段插入适当的表达载体，并加以表达； ⑦分离、纯化表达产物并对其进??功能检测。;（二）蛋白质工程和基因诱变 蛋白质工程中最常用的基因诱变技术是“定点诱变技术”。  利用定点突变技术，即专一改变基因中某个或某些特定氨基酸的技术，可以产生具有工业上和医药上所需性状的蛋白。 ① 改变酶促反应的Km与Vmax，可改变反应的催化效率； ② 改变蛋白的pH值或温度稳定范围，借以改变蛋白质的反应条件； ③ 改变酶在非水溶剂中的反应性，以使蛋白质在非生理条件下也能发挥作用； ④ 改变某种酶的结构特性，使其无须加入辅助因子就能催化反应，简化持续生产过程； ⑤ 提高酶对底物的亲和力，以增强酶的专一性，减少不必要的副反应； ⑥ 增强蛋白对胞内蛋白水解酶的抗性，可简化蛋白质的分离、纯化过程，以提高产率； ⑦ 改变酶的别构调节部位，减少反馈抑制的影响，提高产物的得率； ⑧ 提高蛋白的抗氧化能力； ⑨ 根据需要改变酶的底物专一性； ⑩ 改变蛋白质发生作用的种属特异性。;二、蛋白质的功能域及其模拟肽 （一）功能蛋白质结构特点 1．结构域（domain）  蛋白质的三级结构（tertiary structure）是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。分子量大的蛋白质三级结构常可被分割成一个或一个以上的球状或纤维状的区域，折叠的较为紧密，各行其功能，称为结构域。 如纤维连接蛋白（fibrenectin），它由两条多肽链通过近C-端的两个二硫键相连而成，含有6个结构域，每一个结构域执行独立的功能，如细胞结构域、胶原结构域、DNA结构域和肝素结构域等。;2．蛋白质中必须氨基酸的线性分布及空间分布 作为有活性的生物分子，要发挥其功能特点，一般要具备下述几个要素： ①信息量丰富，从生物进化的的观点来衡量，其分子内部还具有发展变异的内在因素； ②反应灵敏，极微量就能起作用； ③能作用于特定的靶细胞并引起细胞内特定的生化和免疫应答反应； ④在应激状态下，能迅速从非活性状态转化为活性状态（即加工、装配过程）； ⑤它们功能作用的发挥，还必须受到一系列反馈和制约因素的控制。 到目前为止，只有蛋白质多肽分子能满足上述所有的要求。至于核酸分子，由于所含信息量大、不易通过细胞膜、运转不便等原因、只能在细胞内部发放高级指