2010生物高考相关复习《遣传与进化》专题系列课件19《基因工程》.ppt

筛选克隆 pUC18载体还携带了抗生素（antibiotic）基因，可筛选重组质粒。 一般克隆基因的检查和鉴定方法 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻力 ——不同迁移率 分子量标准参照物 酶切和电泳方法 Restriction mapping 酶切 克隆基因的检查和鉴定方法 32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法 DNA杂交直接鉴定 植物遗传转化常用的方法 载体法转化——农杆菌介导法（Ti质粒） 基因的直接转移 （1）高压电脉冲电激穿孔 （2）基因枪法 （3）微注射法 构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株（直接转化重组质粒） 纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析 11.5 转化子的分析——Southern杂交 鉴定克隆---Southern分子杂交 Southern杂交分析示例 A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中 1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。 1988年，美国国家卫生院和能源部 迄今为止在生命科学领域最宏大的研究计划—人类基因组计划 主要内容是完成人体23对染色体的全部基因的遗传作图和物理作图，完成23对染色体上30亿个碱基的序列测定 以美国为主、包括英国、法国、日本和中国多国科学家参加的国际合作计划 9.7 人类基因组计划 2010生物高考复习 《遣传与进化》专题 系列课件 19《基因工程》 11 重组DNA技术 11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术 11.2 获得需要的目的基因（外源基因） 11.3 构建重组质粒和基因克隆 11.4 转化受体细胞和转化子的筛选 11.5 转化子的分析——Southern杂交 重组DNA技术，又称为基因克隆或分子克隆技术， 克隆(clone)---无性繁殖 分子克隆– DNA的无性繁殖技术 重组DNA技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术 基因工程(genetic engineering) 所谓基因工程(genetic engineering)就是把外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表达的操作叫基因工程。 基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或表达所需要的产物。 重组DNA操作一般步骤： （1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。 （4）化学合成 11.2 获得需要的目的基因（外源基因） 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建 细胞内总DNA的提取分离程序 苯酚沉淀蛋白质 基因组DNA文库的构建 将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。 cDNA文库的构建 mRNA 反转录 cDNA (互补DNA） 第二条DNA链 反转录人工合成互补DNA, cDNA 构建基因文库获取目的基因存在的问题—— 费时费事 内含子序列 反转录人工合成互补DNA方法的优势—— 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因 聚合酶链式反应（PCR） PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。 加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4