25第二十四章 重组DNA技术知识.ppt

DNA链末端合成终止法 DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸（或同一测序引物），然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 重组体 载体自连 目的基因 自连 （二）平端连接效率较低 为了提高连接效率，可采用提高连接酶用量、延长连接时间、降低反应温度、增加DNA片段与载体的摩尔比等措施 平端连接同样存在载体自身环化、目的DNA双向插入和多拷贝现象等缺点 （三）粘-平末端的连接效率介于黏端和平端连接之间 粘-平末端连接是指目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接 以该方式连时，目的DNA为定向插入载体（即定向克隆） 该连接方式的连接效率介于黏端和平端连接之间 可采用提高平端连接效率的措施来提高该方式的连接效率 （四）快速连接法无需纯化DNA片段 该方法从低融点琼脂糖凝胶中直接切下所需的DNA片段，无需纯化，连同凝胶一起与载体DNA进行连接。本法省时省力，对DNA黏端和平端的连接均适用，但其连接效率明显低于常规连接，且DNA连接酶用量大。 四、重组DNA转入受体细胞（转） 转化（transformation） 质粒或黏粒→细菌 （感受态细胞，competent cell） 质粒→酵母菌（真核细胞） 转染（transfection） 外源DNA→真核细胞（酵母除外） 噬菌体DNA→感受态细菌 感染（infection） 噬菌体颗粒→细菌 病毒颗粒→哺乳细胞 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 细菌的感受态（ competent bacterium）：细菌易于接纳外源物质的一种天然状态，在细菌的对数生长前期，为了分裂增殖的需要，细菌胞膜上会表达一些特殊的蛋白质，利于外源物质穿透胞膜，帮助细菌吸收外源营养物质。基因工程操作中，通过物理化学的方法也可使细菌处于感受态。处于该状态的细菌被称为感受态细胞。 将重组DNA转入受体细胞的常用方法 化学法： 氯化钙化学转化 物理法： 电击法 显微注射法 等 用氯化钙化学转化 电击法 显微注射法 五、筛选与鉴定重组DNA有多种方法（筛） 一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆 筛选与鉴定程序主要包括：先筛选出带有载体的克隆；然后筛选鉴定出带有重组载体的克隆；最后筛选鉴定出带有目的DNA的克隆 主要筛选和鉴定方法有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等 （一）借助载体上的遗传标志可快捷方便地进行筛选 1. 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子 将含有某种抗生素抗性基因的载体转入宿主细胞后，将细胞在含有相应抗生素的培养基中培养，无载体转入的细胞将被杀死，生长的细胞即是含有载体的细胞。至于细胞中的载体是否为含有目的DNA的重组载体，尚需进一步鉴定。 抗药性标志筛选 抗性平板 2. 利用标志补救筛选带有载体的重组子 标志补救（marker rescue）是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，通过互补宿主细胞的相应缺陷而使细胞在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选带有载体的重组子。 标志补救也可用于外源基因导入哺乳动物细胞后的阳性克隆的初筛。例如，当把带有dhfr标志基因的真核表达载体导入dhfr缺陷的哺乳类细胞后，则可使细胞在无胸腺嘧啶的培养基中存活，从而筛选出带有载体的克隆。要确定是否为带有重组载体的阳性克隆，还需进一步鉴定。 3. 利用不同遗传标志可筛选出带有重组载体的克隆 （1）利用抗性基因的插入失活可筛选带有重组载体的克隆 诸多载体都带有抗生素抗性基因，当外源DNA插入某一抗性基因内，便可使该抗性基因失活。借助该抗性标志及载体上的其他标志，便可筛选出带有重组载体的克隆。 插入失活筛选带有重组载体的克隆 （2）利用抗性基因的插入表达也可筛选带有重组载体的克隆  例如：质粒pTR262携带来自λ噬菌体的CI基因，该基