4 电泳教学讲义.ppt

第四章 电 泳;内 容;郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》 ;第一节 电泳概述;1. 电泳：带电的胶粒或大分子在外加电场中向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。; pHpI 分子带负电荷，在电场中向正极移动; pHpI 分子带正电荷，在电场中向负极移动;;二. 基本原理;三. 分 类;2、按支持介质形状不同可分为： ⑴ 薄层电泳 ；?? ⑵ 板电泳 ；?? ⑶ 柱电泳;第二节 琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶: ;琼脂糖的基本结构 ;琼脂糖凝胶的分辨力 : ;1）影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素;不同琼脂糖凝胶浓度的分离范围: ; 电压的影响: 低电压时,线状DNA分子的迁移率与所加电压成正比; 随着电场强度的不断增加,高分子量DNA的迁移率将以不同的幅度增长. 一般情况下电压应为5V/cm。 ;琼脂糖电泳的染料：;溴化乙锭的分子结构 ;室温、稳压，水平电泳。;;电 泳 法 估 算 微 量 DNA 样 品 的 量;2）利用琼脂糖凝胶电泳制备和纯化DNA片段;1.1.2利用琼脂糖凝胶电泳制备和纯化DNA片段;具体方法：在经过电泳的凝胶中、紧靠目的DNA前方切一裂隙，然后插入条状DEAE-纤维素膜继续电泳，DNA片段被收集到膜上，用低离子强度的缓冲液洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中将DNA洗脱下来。;C． DEAE-纤维素膜的电泳回收法：;第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳; 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(CH2=CH-CO-NH2) 和N-N＇亚甲基双丙烯酰胺(CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH-CH2)聚合而成的． ;;丙烯酰胺单体在过硫酸铵提供的自由基的作用下，可聚合 成长链，其中，每29个丙烯酰胺单体可形成1分子的交联 体（交联度），当双功能基团的N-N′亚甲基双丙烯酰胺 参与聚合反应时，链与链之间就交联形成凝胶。另外，在 制备聚丙烯酰胺凝胶时，还需要加入一种物质——N-N四 甲基已二胺（TEMED），其作用是稳定自由基。 ;丙烯酰胺(w/v%) ;低温（4℃）、稳流、垂直电泳方向。;样品的浓缩效应 电荷效应 分子筛效应;A. 样品的浓缩效应;A. 样品的浓缩效应;A. 样品的浓缩效应;A. 样品的浓缩效应;A. 样品的浓缩效应;B.电荷效应;C.分子筛效应;三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型;2、 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;各部分凝胶配制;;四、SDS分离蛋白质;;1.安装膜具;装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口;盖上凹玻璃;将凹玻璃冲外装进槽里;将楔子插进，将底部插紧;2. 配制凝胶溶液;插入梳子;胶凝后用夹子将玻璃夹出;用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉;旋转180度，凹玻璃向里;将玻璃放进槽内;加缓冲液;4. 样品制备： 将0.5ml 样品液， 0.25ml 10% SDS和0.25ml 1%巯基乙醇于小试管中，置100℃水浴中煮沸3分钟后，取出冷却，然后，加入0.25 ml 上样缓冲液（0.05%溴酚兰+ 40%蔗糖溶液），混合。取出混合样品40微升加入样品槽，每个样品重复两个。 ;5. 加 样;6. 电泳;电泳： 接通电源，电流恒定为80mA，待溴酚兰指示剂移至离下端0.5cm（约3小时），切断电源，拔去插头，倒出电极缓冲液于大烧杯中（如此缓冲液欲重用时，应把正负电极液分别贮存）。 ;7. 剥 胶;8 染色： 考马斯亮蓝染色，详见教材 9 脱色;第四节 蛋白质双向电泳;将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。;生物学问题的提出;蛋白质组研究的基本技术路线; 蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。双向电泳由Ｏ’Ｆarrell于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化 。;二、双向电泳原理;;;;第二向： SDS;;5;; 2 -ＤＥ面临的挑战是高分辨率和重复性 ：高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比。 目前可以精确制作线性、渐进性和Ｓ型曲线，范围或宽或窄的pH梯度. 新的酸性pH3-5或碱性pH6-11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH4-7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群从而有效分离。; 分离后的斑点检测亦很重要 .所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度