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1 第五章 基因的分离 2 第一节 基因的分离 3   一. 获得基因的一般方法 1. 化学合成方法 主要用于较小基因的合成, 或需改变密码子的基因。 2. 半化学合成法 mRNA → cDNA → 加人工接头或合成一段DNA → 与载体相连 3. 筛选法 用于各种方法从基因组文库或cDNA文库中选择目的基因。 4 1. 遗传互补法 1)  原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后, 如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。 i. 营养缺陷型:受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布在合成培养基上 → 原养型细胞生长 ii. 受体细胞:(无某种表型)+ 外源DNA → 转化细胞涂布在特殊培养基上 → 具有新性状细胞 iii. 虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性, 但当转入目的基因后, 该细胞可过量产生此酶活性, 这亦可用于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的。 二. 基因的筛选方法 5 实例：基因组文库DNA → 转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→ 转化细胞（leu2/LEU2,Leu+）→LEU2基因 基因组文库DNA →转化E.coli（无纤维素酶活性）→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈 →纤维素酶基因 优点:简便,快速,可靠,是首选方法. 获得的基因一定是完整基因. 缺点: 适用范围较窄。 必备条件:外源基因不仅能在受体细胞表达,而且必须具备生物学活性。 6 分离基因组文库重组DNA分子 → 转化适当宿主细胞 → 涂布在选择培养基上→随机挑选阳性克隆,分离重组DNA分子 →再转化相同受体细胞 → 高频转化子 →基因的进一步证实和鉴定   重组DNA转化细胞 SDS→出现新蛋白质 原载体转化细胞(一) 制备无细胞抽提物 酶活测定→酶活性出现 非转化细胞（二） 免疫分析→与特定抗原反应 鉴定工作包括: 限制酶图谱,基因定位,Southern杂交, 序列测定 2) 分离步骤 7 1)原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因（同源序列不是完全相同序列） 优点:不需要基因表达 必备条件:合适的核酸探针或有关资料,外源DNA能在宿主细胞中扩增 2)核酸探针种类 i. DNA探针: 分离自某一种生物 ii. 寡核苷酸探针: 根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测 iii.cDNA探针: 利用特异性 mRNA反转录而成,亦可用不同mRNA 混合物反转录而成 iv. PCR探针 v. RNA探针: 由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得 2. 核酸杂交法 8 如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala 六肽 QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN 对应 mRNA N：ACGT/U CAN-AAP-GTP-CTP-CG 探针序列 Q：CT/U P：AG 32种14聚体混合物,其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补 * 选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。 **这种探针最好用于目的cDNA分离。若用于分离基因，要事考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能。 ***此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序列设计。 10 1) 原理 外源DNA引人宿主细胞后表达出蛋白质,以此为抗原与相应的抗体发生免疫反应, 然后利用二抗与一抗反应,用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA优点:不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决定序列能被正确表达。 *外源DNA可以是一个完整编码区,也可能是一个外显子,这些序列可以插入E. coli表达型载体。 必备条件：待分离基因的表达产物—蛋白质必须纯化和用于制备相应抗体。 3. 免疫法 11 2) 分离步骤 基因文库→蛋白质样品膜制备→免疫法筛选→有色斑点(阳性克隆)→进一步证实.分离阳性克隆无细胞抽提物,作斑点印迹,western印迹免疫分析;分离重组DNA,检测插入片段大小,测序等. 12