7(2011y)第7讲 分子克隆工具酶9.13演示教学.ppt

第二章 基因工程载体和工具酶第二节 分子克隆工具酶 ; 在过去20多年里，生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为DNA物理图的特殊标记，利用限制性内切酶可产生特定大小的DNA片段并使纯化这些DNA片段成为可能，获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质。对DNA进行修饰的工具的出现，为重组DNA的实现创造了条件;一 限制性内切酶;修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。;【DNA甲基化】DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下,在基因组CPG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基。它是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。 【表观遗传学】是与遗传学(genetic)相对应的概念。是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等 ;（二）限制性核酸内切酶(restriction ednonuclease) 1.限制性核酸内切酶的概念 【限制性核酸内切酶】是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609种,II型中共有223种具有特异性。;2.限制性核酸内切酶的命名原则 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类 ①限制性核酸内切酶 第一个字母（大写，斜体）：代表该酶的宿主菌属名 第二、三个字母(小写，斜体)：代表宿主菌 种名(species)。 第四个字：母代表宿主菌的株或型(strain)。 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发 现和分离的先后顺序用罗马字母表示。;限制性核酸内切酶的命名原则： 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶;4.Ⅱ限制性核酸内切酶的功能 【Ⅱ型限制性核酸内切酶】有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。 ;粘性末端 　　当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸片段，即5’突出。这些片断可以通过重叠的5‘末端形成的氢键相连，或者通过分子内反应环化。因此称这些片段具有粘性，叫做粘性末端。 　　当限制性内切酶作用于特定的DNA时，把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况： 　　a：沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端； 　　b：在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。 例如:EcoRI限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在G和A间切开，得到的就是两个黏性末端（之间可以根据碱基互补配对原则重组） ;;;;5.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作 ◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT（二硫苏糖醇 ） 1mmol/L Volume 20-100μL Temperature 37℃ Time 1-1.5h ◆【1个单位限制性核酸内切酶】在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。;6.Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。 ②建立DNA分子的限制酶图谱。 ③构建基因文库。 ④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。 ⑤改建质粒。;7.影响限制性核酸内切酶活性的因素 ①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SD