7一级结构测定教材课程.ppt

蛋白质序列测定的基本战略和步骤 蛋白质和肽的氨基酸组成分析 末端氨基酸的测定 肽链的专一性水解和肽段的分离纯化 肽段的序列测定 由已知序列肽段建立蛋白质一级结构 内 容 提 要 （第七讲） 二、C-末端的测定 （一）肼解法 蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其它的氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。 无水肼（H2NNH2） 100℃ ＋… ＋ ＋ C-末端氨基酸 （n-1）个氨基酸酰肼 肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏，不易测出， C-末端的精氨酸转变为鸟氨酸。 （二） C-末端选择性氚标记法 这是测定C-末端较好的一种方法，专一性强，灵敏度高。 乙酸酐 T2O（氚水） B H+ 噁唑酮环 蛋 白 质 或 肽 的 Ｃ 端 残 基 的 氚 标 记 但此法不适于C端为Pro和Asp的情况。 - （三）减数C-末端测定 玻璃 球 玻璃 球 玻璃 球 此法仅适 用于小肽。 （四）还原法 用硼氢化锂将C末端氨基酸还原成相应的α-氨基醇，随后将此肽完全水解。 酰叠氮化物 异氰盐 二-P-硝基苯磷酸 酰叠氮化合物 （五）羧肽酶法 此法最常用，也非常有效。羧肽酶是一类外肽酶，能专一性地从肽链C端逐个降解，释放出游离氨基酸。 + 剩余肽链 C端氨基酸 羧肽酶 时间 释放的残基数 1 Thr Thr Val Phe 时间 释放的残基数 C末端是Thr C端顺序是Thr-Val-Phe 酶 来源 专一性 羧肽酶A（CPA） 胰脏 除Hypro外的所有氨基酸 羧肽酶B（CPB） 胰脏 Arg、Lys 羧肽酶C（CPC） 柑橘叶 羧肽酶Y（CPY） 面包酵母 所有氨基酸 4种羧肽酶的性质 除Arg 、 Lys 、Pro、Hypro外的所有氨基酸 第四节 肽链的专一性水解和肽片断的分离纯化 一、肽链的专一性水解 方法 化学法 酶法 （一）蛋白质的化学裂解 化学法裂解的肽段一般较大，适合在自动序列分析仪中测定序列。 1.溴化氰裂解 Br- 溴化氰基锍 溴化氰 - 只断裂由甲硫氨酸残基的 羧基参加形成的肽键 H2O 溴化亚氨内酯 + H3N+—肽 原C-末端肽段 N-末端肽段 肽酰高丝氨酸内酯 甲基硫氰酸 含羟基侧链的 Ser、Thr干扰 反应，不能裂 解肽键。 -HBr +（O） +H2O 可在Trp残基的C-末端一侧裂解肽键。 缺点是试剂对光敏感，反应要在暗处 进行。 3. 亚碘酰基苯甲酸裂解法 在温和的条件下裂解Trp-X肽键，反应机理也是氧化吲哚环。 + 亚碘酰基苯甲酸 H2O + H2N- 4. X-Cys键的裂解 + + + 2-硝基-5-硫氰苯甲酸 （NTCB） 5. 羟胺裂解 —Asn—Gly + NH3 环亚酰胺 NH2OH + + C-末端肽段 C-末端肽段 α-Asp-羟胺 β-Asp-羟胺 断裂Asn—Gly之间肽键 6. Asp-Pro键的裂解 （α） （α，β） （β） -酐 H2O -天冬氨酸 Asp Pro 酸性条件下， Asp-Pro键的水解 （二）蛋白质的酶法裂解 酶法裂解的优点： 专一性强，降解后的肽段容易纯化，产率较高，副反应少，在酸水解中容易受破坏的Glu、Asn和Trp等在酶解中都不受影响。 酶法裂解要考虑以下因素： 1.合适的pH； 2.适宜的反应温度； 3.恰当的蛋白质与酶的比率； 4.选择相应的反应时间； 5.待裂解蛋白质的物理状态。 反应的pH是重要因素，温度、蛋白质与酶的比例和反应时间都能控制产生肽段的速度。 通常，蛋白质与酶 的比例为200：1， 37℃下反应4小时。 Trypsin ：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg残基的羧基参与形成的肽键，得到的是以Arg 或Lys 为C-末端残基的肽段。（专一性较强，水解速度快）。 肽链 水解位点 胰蛋白酶 R2=Pro（抑制水解） 或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu等疏水残基的羧基端肽键。蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。 肽链 水解位点 糜蛋白酶 如果端裂点附近的基团 是碱性的，裂解能力增强； 是酸性的，裂解能力减弱。 R2=Pro（抑制水解） thermolysin)：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ile,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 肽链 水解位点 嗜热菌蛋白酶 是一个含金属锌和钙的蛋白酶， Zn是酶活力所必需的。 R2=Gly或Pro（不水解） R1或R3= Pro（抑制水解） Pepsin：R1或R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 肽链 水解位点 胃蛋白酶 专