Ch14.基因重组和基因工程(中).ppt

3、多聚核苷酸激酶 5’-HO OH-5’ 5’-P P-5’ ATP 4、末端转移酶 3’ 5’ NNNNNNN 5’ dNTP 5’ 3’ 5’ NNNNNNN 5、碱性磷酸酶 5’-P P-5’ 5’-HO OH-5’ （三）目的基因（ target DNA） cDNA gDNA （四）基因载体（ vector） 1、概念 (concept) 2、种类 (types) bacterial plasmid DNA，质粒 cosmid DNA，粘粒 phage DNA，噬菌体 viral DNA, 病毒 yeast artificial chromosome， 酵母人工染色体 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 3、分类 3、结构特点 (features of structure) 复制起始点(origin of replication) 单一的限制酶切割位点(cloning site) 选择标记(selection marker) 三个基本要素 二、重组DNA技术的基本流程 获得目的基因　　　　选择/构建载体 重组DNA分子 导入受体细胞 筛选转化细胞 外源基因表达 一、 目的基因的获取 1、化学合成 2、基因组DNA (genomic DNA library) 3、cDNA (cDNA library)4、聚合酶链反应（PCR） 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 * 从基因组DNA文库获取目的基因 目 录 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 * 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 目 录 K B Mullis M Smith Shared the Nobel Prize in Chemistry 1993. PCR技术基本原理 （二）载体的选择与构建 载体的功能：携带外源DNA进入宿主细胞， 并使之在宿主细胞中繁殖 载体的选择: 宿主细胞类型 插入片段大小 克隆or表达 （三）载体与目的基因的连接 1、粘性末端连接 （1）同一限制酶切割产生的粘性末端 限制酶；DNA连接酶 （2）不同限制酶切割产生的粘性末端 2、平末端连接 目的基因 载体 RE RE T4 DNA ligase 重组体 载体自连 目的基因 自连 3、同聚物加尾连接 末端转移酶 AAAA AAAA TTTT TTTT A A AA AAAA TTTT T T T T 4、人工接头连接 第十四章 基因重组与基因工程 孙凌云 第一节 DNA重组 一、同源重组 内切酶 (recBCD) DNA侵扰 (recA) 分支迁移 (recA) 内切酶 (recBCD) DNA 连接酶 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ Holiday中间体 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ Holiday中间体 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 内切酶 (ruvC) 内切酶 (ruvC) DNA 连接酶 DNA 连接酶 片段重组体 拼接重组体 二、位点特异重组 λ噬菌体DNA的整合 细菌的特异位点重组 免疫球蛋白基因的重排 三、转座重组 （一）插入序列转座 （ insertion sequence） 转座酶基因 反向重复序列 反向重复序列 保守性转座 复制性转座 Barbara McClintock (1902-1992) Cold Spring Harbor Laboratory, NY Nobel Prize in P