DNA和蛋白质互作分.ppt

五、基因定点诱变; 定位诱变技术就是指按照设计要求，在体外将基因特定区域的碱基进行突变，这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗传分析，以便于研究基因结构与功能的关系和基因表达调控的过程。其诱变技术有两种类型，即区域随机诱变和点突变。 ; 点突变的技术有很多种，常见的有寡核苷酸介导的点突变技术和PCR定点突变技术。 ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术 1.盒式诱变 2.寡核苷酸引物诱变技术 ㈡ PCR点突变技术 1.重组PCR定点诱变法 2.引物PCR定点诱变法;㈠寡核苷酸介导的定点突变技术;;2.寡核苷酸引物诱变技术;;㈡ PCR点突变技术;2.引物PCR定点诱变法 该方法是利用三种引物，两轮PCR反应来进行的。 ;;;六、DNA与蛋白质互作分析;外源基因的功能分析涉及蛋白质与DNA的互作分析。 主要方法有： 酵母杂交系统 凝胶阻滞实验 DNaseI足迹实验 甲基化干扰试验 体内足迹实验;一）酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system);;;;;2.实验过程;4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。 5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互作用的新基因。;;AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain;; 酵母双杂交的基本原理示意图;酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。;原理： 将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。 ; * 顺式作用元件 真核生物DNA序列（非编码序列）和被转录的结构基因距离较近，和转录调控有关。 A 启动子（启动子上游近侧序列） B 增强子 C 沉默子 ;启动子（promtor）在转录起始点上游约100－200bp以内，每个元件长度约为7－20bp，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始点和转录频率的关键元件。 增强子(enhancer)能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，顺式作用元件（DNA序列）。 沉默子(silencer)负性调节元件，与相应的反式因子结合后，可以使正调控系统失去作用，阻遏基因转录。 ;从拟南芥cDNA文库中 筛选与顺式元 件DRE结合的 转录因子示意图。;三）凝胶阻滞实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）;原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。所以，当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。;;EMSA 还被用于研究与蛋白质相结合的DNA 序列的特异型。;四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing） ;? 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。 ;;;?? 用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中观察到。 ;;六）体内足迹试验;;七）染色质免疫沉淀实验Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Assay ; 染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。 ;1.CHIP原