DNA测序技术知识及其应用.ppt

;1;1 引言;造福人类的HGP; ;;2.第一代测序技术;化学降解法;化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。 而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。 但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。;双脱氧链终止法;双脱氧链末端终止法测序原理示意图; P; Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 ;荧光自动测序技术;3730全自动测序仪;杂交测序技术;杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。 通过几十年的逐步改进, 第1代测序仪的读长可以超过1000 bp, 原始数据的准确率可以高达99.999%, 测定每千碱基序列的成本是0.5 美元, 每天的数据通量可以达到600000 碱基。; 第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。;2.第二代测序技术;过程概述;2.1 454测序技术;原理图：;测序数据输出：;指示器; 454测序法的突出优势是较长的读长，目前GS FLX测序系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平台的测序成本比其他新一代测序平台要高很多，但对于那些需要长读长的应用，如从头测序，它仍是最理想的选择。 缺点是无法准确测量同聚物的长度。;2.2 Solexa测序技术;原理图;测序过程：;测序过程：;;2.3 SOLiD技术;;测序过程：; 超高通量是SOLID系统最突出的特点，目前SOLID 3单次运行可产生50 GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。 ;表1 三种二代测序技术对比;4. 第三代DNA测序技术;三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术 单分子即时DNA测序技术(SMRT) HeliScope单分子测序 基于荧光共振能量转移的即时DNA测序 纳米孔单分子测序技术 ;第三代测序技术 1、目前一期的读取速度为3bp/ s 2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。 3、它的精度非常高，达到99.9999%。;标记荧光基因;零级波导的纳米结构; ;4.3 基于荧光共振能量转移的即时DNA测序; DNA分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔,利用核酸外切酶的特性来识别出不同的DNA碱基 优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。;优点：;表2 各种测序技术比较;5. 基因测序的应用;全基因组重测序;全基因组重测序;全基因组重测序;全基因组重测序;转录组测序（Transcriptome sequencing）;转录组测序（Transcriptome sequencing）;新型病源体的快速鉴定;艾滋病毒抗药性 HIV sequencing ;外显子目标区域测序;目标外显子组测序vs全基因组测序;目标外显子测序应用;基因测序的展望;光影成像DNA测序技术;光影成像DNA测序技术;