DNA甲基化讲解材料.pptx

DNA甲基化的检测方法-MSAP汇报人：李杰2015.10.05DNA甲基化在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。MSAP用途：最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段。原理：利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。甲基化状态分析：在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。流程聚丙烯酰胺凝胶电泳预扩液酶切液连接液DNA提取选扩液选择性扩增37℃6h16℃连接过夜预扩增大分子分析仪分析注意事项：DNA提取：纯度一定要高，260/280（1.8-2.0），260/230（2.0-2.2）酶切：其质量好坏主要取决于DNA的质量、浓度，酶切时间和酶浓度（DAN浓度200-300ng/μl，酶切6h）选扩之后及时跑胶，不要放置过久聚丙烯酰胺凝胶电泳擦板（95%的乙醇，卫生纸，擦拭三次左右）涂亲和硅烷（5μl冰醋酸、1ml95%乙醇、8μl亲和硅烷）封板（透明胶带）灌胶（60mlPAGE、600μlAPS、60μlTEMED）聚合3h以上即可使用预电泳（1500—2000V、75W，30min以上）电泳（ 1500—2000V、55W ，2-3h）银染（固定-染色-水洗-显色-冲洗）注意事项：1. 灌胶要匀速，防止焦内气泡产生，可以先慢后快不可以先快后慢2. 预电泳前先将点样孔标记，再注入缓冲液（下部盒内缓冲液有一半）3. 预电泳结束后，要将点样孔内的沉淀吹出4. 染色10min,不要过久；水冲洗不要超过10S5. 4月-6月，10月-11月中旬图 1-1聚丙烯凝胶电泳图E-CTG表示不同的EcoRI引物，HM-TCA表示不同的HpaII/MspI引物；21-16为样品名；H: EcoRI/HpaII酶切扩增产物，M: EcoRI/MspI酶切扩增产物。准备芯片（1）使用前芯片在室温中平衡30min（2）吸出孔内保存液，用去离子水清洗三次，依顺序分别加入marker和ladder（3）将芯片放入 LabChip GX/GX II注意事项（1）所有空不能长时间处于干燥状态（2）孔4内marker要及时补充（3）marke可以回收再利用（4）仪器提前开机30min预热（先开仪器在开电脑）软件简要操作流程（1）打开 LabChip GX 软件（2）在主界面上， 点击软件左上角的 Run 按钮， Start Run 对话框弹出，上面有 Output，Run 和 Advanced 三栏（3）点击 Run Tab，DNA 实验可供选择的类型有： 要选择整列，点击相应的列数要选择整行，点击相应的行字母（4）点击 Start 按钮开始实验注意事项：如果更换新的芯片时，需要选择一下PCR板的规格（板高 不能超过16mm，否则针会断掉）图1-2 大分子分析仪电泳图0-3为样品名；H: EcoRI/HpaII酶切扩增产物，M: EcoRI/MspI酶切扩增产物谢谢！