DNA限制性内切酶 分生讨论教学教材.ppt

DNA的限制性酶切原理、步骤、影响因素和酶切结果分析 主讲：叶晨 陈炳宏（麻醉1201） 每当我走进父亲的办公室，总会看见他桌上放着的一些培养皿，里面装的是菌群。它们就象一个住着许多居民的城市，在每一种细菌中都有一个国王，他长得瘦瘦的、高高的。国王有很多仆人，这些仆人长得矮矮胖胖的，跟皮球差不多。父亲把国王叫做“DNA”，仆人叫做“酶”。国王就像一本书，仆人们做的每一件事情在这本书中都有记载。对于我们人类来说，国王记载的这些细目是个谜。 　　我爸爸已经发现了其中的一个仆人，他的工作就像一把剪刀，如果有外国国王来侵犯一个细菌，这个仆人就会把他剪成小碎片，但他不会对自己的国王造成任何伤害。 　　聪明的人类用这个带着剪刀的仆人来探究国王的秘密，他们搜集了很多带剪刀的仆人，并把他们放进一个国王里，这个国王就被剪成了碎片。用这种方法得到的小碎片使人类探究国王的秘密变得容易了。爸爸就是因为发现了带着剪刀的仆人而获得了诺贝尔奖。 限制性核酸内切酶发现 这是瑞士微生物遗传学家W·阿尔伯（1929－）的女儿西尔维娅（当时10岁）在听完父亲给她讲完限制性内切酶后写下的一个故事，限制性内切酶就是故事中带剪刀的仆人。 　　限制性内切酶能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的双链交错地切断。因此，限制性内切酶被称为“分子剪刀”，它可以完整地切下个别基因。 　　1965年，阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在具有切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分离出I型限制性内切酶，但这种酶的切割基因功能不理想。1970年，美国分子生物学家、遗传学家H·O·史密斯（1931～）分离出了II型限制性内切酶。1971年，美国微生物遗传学家D·内森斯（1928～）使用II型限制性内切酶首次完成了对基因的切割。他们的研究成果为人类在分子水平上实现人工基因重组提供了有效的技术手段，他们于1978年获得诺贝尔生理学或医学奖。 DNA限制性内切酶 原理 酶切反应 实验步骤 影响因素 结果分析 讨论 核酸限制性内切酶（restriction enzyme）是一类能识别双链DNA特定碱基序列的核酸水解酶。能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键。 特异位点：特定的碱基序列，通常是4~6个碱基对、具有回文序列的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA分子，产生5ˊ或3ˊ粘性末端。 磷酸二酯键：一种化学基团，指一分子磷酸与两个醇（羟基）酯化形成的两个酯键。该酯键成了两个醇之间的桥梁。例如一个核苷的3ˊ羟基与另一个核苷的5ˊ羟基与同一分子磷酸酯化，就形成了一个磷酸二酯键。 一、实验原理 限制性核酸内切酶都是在原核生物中发现的，可以为宿主抵御外来DNA的侵袭。根据酶的切割特性、催化条件及是否具有修饰性可分为I、II、III型三大类。 I型酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性。其内切酶的识别位点和切割部位不一致，相距几千个碱基，无固定的切割位点，不产生特异片断。 III型酶和I型酶类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活性。此类酶可在DNA链的特异位点切割，但切割位点在识别位点之外，一般相距几十个碱基，对基因工程的意义也不大。 分类 II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶组成。II型限制酶需要Mg2+作为催化反应辅助因子，能识别双链DNA的特定序列，一般为4-6个碱基的反转重复序列。II型限制酶一般在识别序列内进行切割，产生特异的DNA片断。 II型修饰酶识别和II型限制酶一致的DNA序列，但其作用是负责对识别序列的甲基化修饰。 基因工程中使用的DNA限制性内切酶 二、限制性内切酶酶切反应 配制反应体系 DNA：必须具备一定纯度，微量的酚、氯仿、大于10mM的EDTA、去垢剂、及高盐的存在均将影响限制性内切酶的活性。DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的重要因素。 反应缓冲液：不同厂家、不同的酶都有不同的最佳反应条件。应严格按照产品说明书操作。双酶切时要选择两种酶都具有最高活性的缓冲液。 反应容积：在DNA浓度0.4μg/μl的情况下，根据后续实验的要求选择合适的反应容积。过高浓度的DNA会使溶液过于粘稠影响酶的扩散，并降低酶活性。 内切酶及使用的酶量 根据实验要求选择限制性内切酶。 1个酶活力单位的定义：在50μl反应体系中，1μgDNA在推荐的反应缓冲液和温度下反应1个小时，被完全酶切所需要的内切酶的量。 过量的酶可缩短反应时间。但使用过多的酶将导致识别序列特异性下降。一般采用2-10倍的酶量。 加入酶的总容积不能超过反应体系总容积的10%。否则甘油终浓度将达到5%以上，将抑制酶的活性。 酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应温度。反应时间不宜太长，以免内