DNA限制性核酸内切酶谱分析研讨.ppt

* 实验二 DNA限制性核酸内切酶谱分析 3.II型限制性内切酶的特点: 制作 DNA 物理图谱 限制性片段长度多态性(RFLP)分析 基因克隆 DNA 杂交与序列分析 基因同源性研究 2.用途: 1.概念：一类具有严格识别位点并在识别位点内或附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶 一．原理： a.识别序列具有特异性：4～6bp，具有回文结构 BamHI GGATCC CCTAGG 3’ 5’ 3’ 5’ b.5’－末端带磷酸基团 3’－末端带羟基 OH HO c.切口特征 平端 粘性末端 5’ 突出 3’ 突出 4.影响限制性内切酶活性的因素 a.DNA纯度： DNA 附有蛋白质，DNA甲基化，DNA分子太大，DNA溶液含有酚、氯仿、乙醚、过量的EDTA 、SDS等均会降低消化效率 b.Buffer的离子强度: 不同的酶需不同的Buffer 高盐（含 100 mmol/L NaCl ) 中盐（含 50 mmol/L NaCl ） 低盐（含 0-10 mmol/L NaCl c. －20 ℃保存 ,含Mg2+的Tris-HCl缓冲体系，含二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇(ME一般保存于５０％的甘油中 d.防止星号活力 　在非标准反应条件下，限制酶可切割一些与其特异识别序列类似的序列，以*号表示 G A A T T C C T T A A G EcoRⅠ EcoRⅠ* N A A T T N N T T A A N 产生星号活力的原因 甘油含量高（5%, V/V） 酶用量过大（100U/ugDNA） 离子强度低（25mmol/L NaCl） pH值高（8.0） 含有机溶剂(二甲基亚枫，DMSO；二甲基乙酰胺， DMA； 乙醇) 除Mg2+以外，有其它二价阳离子的存在(Mn2+, Cu2+, Zn2+) E.酶的活性单位(1U)：1小时内在50ul容积中降解1ugλDNA所需的酶量 *