Genetic Engineering培训讲解.ppt

;重 组 DNA 技 术;一、重组DNA技术相关概念 ;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ; 限制性核酸内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 聚合酶 (Taq酶、末端转移酶) —用于DNA和RNA的合成 末端修饰酶（多聚核苷酸激酶、碱性磷酸酶）—用于核酸末端修饰 其它酶类—用于细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等;1. 限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease）; 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： ;I型：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。 II型：识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断 。 III型：识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 ;5’ 3’;5 …GTT▼AAC…3 Hpa I 5 …GTT AAC…3 3 …CAA▲TTG…5 3 …CAA TTG… 5 ;5 …G▼AATT C…3 EcoR I 5 …G AATTC…3 3 …C TTAA▲G…5 3 …CTTAA G… 5 ;表15-2一些常用的限制性内切酶位点;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;2、DNA甲基化酶;（2） II型甲基化酶对限制酶活性的影响 １） 抑制同种限制酶的活性 M.BamHI GGATmCC—BamHI(G?GATCC) M.EcoRI GAmATTC—EcoRI(G?AATTC) ２） 抑制不同种限制酶的活性 a. 顺序完全重叠 如：M. ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA） b. 顺序边界重叠 如：M. BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG） ３） 抑制不同种限制酶的部分活性 M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC;5、连接酶;6、DNA修饰酶 ;二、目的基因; 化学合成法 基因组DNA cDNA 聚合酶链反应;组织或细胞染色体DNA;限制酶切位点;3、cDNA文库;4、聚合酶链反应 Polymerase chain reaction;三、基因载体; ;表达载体按进入受体细胞类型分： （1）原核载体：导入大肠杆菌表达大量目的蛋白质。 （2）真核载体：表达真核生物的蛋白质，常用的酵母、昆虫、动物和哺乳类细胞等表达系统。 （3）穿梭载体：既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点。通常在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析。;载体的选择标准;1. 质粒 (plasmid);（1）自主复制性　　能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。 （2）不相容性　　利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争。因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。;（3）可扩增性