Method Introduction of Bisulfite-PCR-SSCP讲解材料.pptx

Method Introduction of Bisulfite-PCR-SSCP专业：生物化学与分子生物学Introduction DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。IntroductionBisulfite-PCR-SSCP：是甲基化敏感性单链构象分析（MS-SSCA）的另一个称呼，由Maekawa等在1999年将重亚硫酸盐转化和PCR-SSCP技术结合起来用于甲基化分析，并认为该法可用于多个标本的甲基化状态的鉴定、甲基化差异的定量和扩增的DNA片段中甲基化杂合性的检测。重亚硫酸盐使DNA中的未甲基化的C?U，而甲基化的C则保持不变的这种甲基化与非甲基化的差异，其本质为单碱基变异，故可用于SSCA分析。这是一种简单的筛查大量标本中甲基化状态的方法，由于所有的带均可被分离并可直接用于测序，故能提高测序效率，并且甲基化程度越高，检测效率越好。Method 方法：先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CpG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳，由于DNA电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA的空间构象，而后者又由DNA碱基的序列决定。因此，经处理后变性的单链DNA将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分离开，随后行单链构象多态性分析加以明确。重亚硫酸盐处理DNA后，设计引物（非CpG二核苷酸区）对处理后的DNA进行扩增， 产物解链后行聚丙酰胺凝胶电泳，由于甲基化和非甲基化单链DNA形成不同的空间构象，它们在电泳中移动速率不同， 故出现在不同位置，从而判定待测片段中甲基化情况。Method 重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的C脱氨基转变成U，而甲基化的C保持不变，对处理过的目标DNA进行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则U全部转化成T。最后，对PCR产物进行SSCP，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。亚硫酸氢钠处理DNA的结果示意Unmethylated DNAOriginally DNAggg gcg gac cgc gSodium bisulfite modificationggg gtg gat tgt gMethylated DNAOriginally DNAggg gcmg gac cmgcm gSodium bisulfite modificationggg gcmg gat cmgcm gOutline of the BiPS procedureMain Procedure DNA修饰引物设计及PCR电泳检测结果验证MethtPrimer 引物设计 网址：/methprimer//methprimer/ 以Apaf-1启动子序列为例 http://www.ebi.ac.uk/embl/httphttp://www.ebi.ac.uk/embl/://www.ebi.ac.uk/emblhttp://www.ebi.ac.uk/embl//PCR-CSCP引物设计关键?引物长度以20～30 bp为宜；?上下游引物之间和同一引物之间内均不能有互补序列，且每一引物本身不存在回文序列；?引物中G+C比例应达50%～60%；?上下游引物退火温度(一般)要保持一致；?引物与扩增片段中间区域和互补率要低；?引物所扩增的目的基因在基因组间最好不要有同源序列；?上下游引物的设计要考虑被扩增的片段长度在SSCP技术可分辨的范围之内，一般来说在400 bp以下。PCR反应 运用不同的引物及扩增不同的目的基因其反应体系构成会有差别，特别是Mg2+浓度、退火温度对扩增的特异性影响较大。SSCP分析用凝胶浓度很重要，一般来说凝胶浓度在8%～12%之间，DNA片段越长，凝胶浓度应越小。染色的方法有3种:可用ErB(溴乙锭)染色、银染或放射性自显影。电泳结果分析及验证 1.Bisulfite-CR-SSCP分析结果受多种因素如电泳温度、离子强度(即电泳缓冲液浓度)、凝胶浓度、甘油的浓度和交联剂亚甲基双丙烯酰胺的浓度等的影响。不同的实验条件甚至可能导致完全不同的结果；2.在室温,通风冷却条件下电泳,少量片段的条带难以分离。Advantages and disadvantage