刘宝DNA甲基化演示教学.ppt

表观遗传学创新实验5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组  DNA甲基化的影响 庞劲松 刘宝 东北师范大学生物基础实验教学中心 表观遗传学与DNA甲基化 DNA甲基化作用 DNA的甲基化及其方式 DNA甲基化的生物学意义 DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成 DNA胞嘧啶甲基化检测 检测方法：MSAP，bisulfite sequencing 5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 实验目的 实验材料 仪器 试剂 实验方法 5’-氮胞苷处理水稻幼苗 植物基因组DNA的提取与纯化 基因组DNA酶切-连接接头 PCR扩增：预扩增，选择性扩增 PAGE电泳 预期实验结果 注意事项与建议 思考题 参考文献 表观遗传学： 不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。 表观遗传变异包括: X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。 表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。 DNA甲基化： 在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。 DNA甲基化的方式 胞嘧啶甲基化 腺嘌呤甲基化 DAM (DNA腺嘌呤甲基转移酶) 识别回文序列GATC, 在此位置两条链的腺嘌呤N-6位置上同时甲基化，同时SAM转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸) 在DMT(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化 DNA甲基化作用 图1 胞嘧啶甲基化过程 图2 腺嘌呤甲基化过程 DNA甲基化的生物学意义 影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录 图3 甲基化与基因沉默 参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态 提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型 DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成 从头甲基化 (de novo methylation) DNMT3a，DNMT3b 在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。 维持甲基化 (maintenance methylation) Met1，DNMT1 较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责 在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化 状态给新合成的DNA链上加上甲基。 图4 两种胞嘧啶甲基化方式 DNA胞嘧啶甲基化检测方法 使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性： 甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) 胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序： 重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing) GCmTACT 重亚硫酸钠 GCmTATT 测序 测序 此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等 MSAP 用途： 最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段 原理： 利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。 甲基化状态分析： 在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。 表1 甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果 原始序列 内切酶 CCGG CCmGG CmCGG Hpa II CC GG 不切割 不切割 Msp I CC GG CCm GG 不切割 重亚硫酸盐测序 图5 重亚硫酸盐测序原理 5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 实验目的 使用不同浓度的5’氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。 实验材料 水稻：日本晴 (Oryza sativa var japonica, nipponbare) 5’氮胞苷如何影响基因组DNA甲基