基因组学(第4y)教学讲义.ppt

A E C G H F D B 4.6 2.0 3.3 2.5 4.0 0.5 0.2 1.0 EcoR I 在此DNA片段上的酶切图谱 Answer 限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，限制性作图更适合于小分子片段。 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小 染色体→酵母人工染色体重叠群→单个YAC克隆→cosmid人工染色体重叠群→单个cosmid克隆→质粒亚克隆→随机测序→计算机分析串联获得大片段 ③限制酶切物理图技术路线 首先确定基因组的遗传标记，如STS； 高精度物理作图 低精度物理作图 端粒重复序列（telomeric repeat ， TEL） 定位于染色体末端一段序列 着丝粒（centromere ， CEN） 有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点 自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） 含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号 酵母人工染色体(YAC)载体 赭石突变抑制基因 YAC文库构建： YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb. Cosmid黏粒(柯斯载体)：质粒+cos序列 黏粒是由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的载体。黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨苄青霉素抗性标记、cos位点。 pHC79 6400 bp Tcr l fragment cos ori Apr PstI BamHI SalI Cosmid pHC79由λDNA片段和pBR322质粒DNA联合组成 pBR322质粒(p43) 克隆片段大小：36-51kb 黏粒有4个特点： ②荧光原位杂交(FISH)作图 荧光原位杂交(FISH)是用标记有荧光分子的一小段DNA序列(探针)，在合适的湿度和盐离子浓度条件下，与染色体上的互补序列特异退火结合而不破坏染色体的整体形态，以便在显微镜下观察到此特异的DNA序列的存在及其在染色体上的位置。 多色荧光原位杂交 染色体涂染探针 位点特异型探针 荧光原位杂交作图染色体细长为宜 ③序列标记位点作图(STS) STS作图通过对基因组片段进行分子杂交和PCR分析，来对短序列进行定位作图。 STS作图原理 STS标记是染色体上位置已定的、核苷酸序列已知的且在基因组中只有一份拷贝的DNA短片段，一般长200—500bp。 以特定STS片段为标记探针，如可和两个YAC染色体DNA库杂交，则表示这两个克隆片段彼此重叠。 如果2个STS标记出现在同一个YAC克隆中，可以STS片段标记探针为引物对YAC克隆进行PCR扩增，鉴定出阳性克隆并测序，然后利用软件分析确定STS在染色体上排列。 STS作图方法 制作来自单一染色体或基因组的(酶切和部分酶切)重叠DNA片段，使每一STS位点有多条片段对应； 分析两个STS位点共存于一个片段的概率，由此计算STS位点距离，绘制图谱； STS作图的图距是根据分离频率计算的。 6 shared fragments 2 shared fragments (二)基因组物理图谱的用途 基因组物理图谱是DNA序列测定的基础，它是测序工作的第一步； 为基因定位、克隆和基因之间的相互关系分析提供有效途径； 三、基因组序列图 两种策略： 全基因组随机测序(美国Celera公司); 以物理图为基础，以大片段克隆为单位的定向测序战略(公共领域测序计划); ①全基因组鸟枪法 将全基因组进行随机打断成2kb小片段DNA; 把小片段装入适当载体，构建质粒文库； 从中挑取克隆进行测序； 最后通过克隆片段的重叠序列组装成大片段DNA序列； 籼稻全基因组“精细图”的绘制(2002年12月，中国) 第3章 基因组作图 基因组作图 应用遗传学标记对基因组进行精细的划分，进而标示出DNA的碱基序列或基因排列工作。 主要包括：遗传图(genetic map)、物理图(physical map)、序列图(sequence map)和基因图(gene map) 一、基因组遗传图 通过遗传重组所得到的基因在染色体上线性排列图，称为遗传连锁图，简称遗传图。 通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率来确定基因的相对距离，一般用厘摩(cM)表示。1cM=1%重组率 。 (一)遗传作图标记 由结构基因标记发展到DNA分子片段标记。 遗传标记的发展： 第一代标记 经典