实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)讲解材料.ppt

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质粒DNA酶切 (质粒限制性内切酶消化酶切);背景知识;  第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。 Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。 tetr 可以阻止四环素进入细胞。 camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活 hygr 使潮霉素β失活。;第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。 第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。 第五步:是否含有表达系统元件,即:启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。;农杆菌复制起始位点;二、限制性内切酶;1) 概念;2) 命名原则;4) 基本特性及用途;;;;Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ① 在特异位点上切割DNA,产生特异的限制性酶片段。 ② 建立DNA分子的限制酶图谱。 ③ 构建基因文库。 ④ 用限制酶切出的相同粘性末端,以便重组。 ⑤ 改建质粒。;5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素;① DNA样品纯度 A)样品杂有RNA 虽不影响酶反应速度,但RNA很易与酶蛋白发生非特异性结合而减少酶有效浓度,使酶解不彻底;另外,干扰DNA片段电泳观察。 B)少量的蛋白质污染 对酶解影响不大,但若有核酸酶等蛋白质污染时,会干扰酶切反应,并影响酶解产物。 C)样品中杂有其他DNA 如质粒DNA中杂有染色体DNA,虽不影响酶解作用,但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 D)其他杂质 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,会影响酶切速度,甚至改变酶的识别特异性,出现酶的第二活性。;② DNA样品甲基化程度 限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应,则该DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早发???的修饰途径之一, DNA甲基化现象广泛的存在于原核和真核生物中。 如:;③ 酶的星活性 (star activity);6) Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项   ①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液,每次操作时应使用新的吸头去取酶;加入酶的体积应不超过总体积的10%,否则酶液中的甘油浓度超过5%时酶易产生星活性。   ②整个操作应在0℃进行,即在冰浴中进行,而且是在加入其它试剂之后,最后加入酶。   ③当切割大量DNA时,通常采用延长反应时间,减少酶的用量。   ④当DNA需2种或以上酶切时,应用通用缓冲液;若没有通用缓冲液时,只有用1种酶切完后,纯化酶切产物,再进行下一个酶切反应。 ;实验目的;实验原理; 限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为:   ; 则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为:1600bp、2624bp和6325bp的三条DNA 片段; 基因组DNA中由于有较多的EcoR Ⅴ识别位点,因此,经EcoR Ⅴ酶切后产生大小不一的条带,电泳后整个泳道呈现均一的亮带。;实验材料和试剂;实验仪器;;实验注意事项;思考题

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